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金黄色葡萄球菌α溶血素基因的克隆、突变和表达及其在细胞玻璃化保存上的初步应用

作　者: 施伟庆
导　师: 孙怀昌
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 金黄色葡萄球菌α溶血素基因克隆突变原核表达可控孔形成蛋白细胞内玻璃化保存
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

玻璃化保存技术的发展和应用，使血清、酶等许多生物制品在常温下长时间保存成为可能，但此项技术目前仅适用于非细胞性生物材料，对细胞保存效果不佳，所以研制一种新的细胞内玻璃化保存方法显得很有意义。本研究根据已发表的金黄色葡萄球菌α溶血素（α-HL）基因序列设计引物，用高保真PCR扩增法从金黄色葡萄球菌标准株1800基因组DNA中扩增出0.9kb的α-HL基因，将其克隆入pGEM-T载体，序列测定结果显示，所获核苷酸序列与已发表的金黄色葡萄球菌标准株Wood 46 α-HL序列同源性大于99％。为获得可控孔形成蛋白H5，设计两对引物来改造α-HL，以H5-5′ F和H5-5′ R为一对引物，用PCR方法在α-HL 5′-端引入编码ompA信号肽序列，并将α-HL编码第130-134号氨基酸的碱基替换为连续的5个组氨酸（His）序列；另一组以H5-3′ F和H5-3′ R为一对引物，用PCR方法扩增α-HL 3′-端。将两段PCR产物分别克隆进pGEM-T载体中，测序鉴定正确后将其切下同时插进pET-30a中相应位点，构建成原核表达载体pET-H5，测序结果显示接头部位和ORF正确。将pET-H5构件转入BL21（DE3）pLysS大肠杆菌中，经IPTG诱导后表达分子量正确的35kDa左右的H5蛋白。重组菌超声波裂解产物上清经Ni柱亲和层析和酸性缓冲液透析后，获得单一条带的表达产物。用纯化的H5与兔红细胞（rRBC）作用，结果显示H5蛋白能使rRBC溶血，HC₅₀值为180ng/ml；分子开关试验结果表明，H5在细胞膜上形成的孔可由Zn²⁺的有无来控制其关闭和开启；将H5与PA317鼠成纤维细胞作用，经台盼蓝染色和高浓度海藻糖作用，细胞染色和细胞体积变化结果表明，正常情况下不能自由透过细胞膜的台盼蓝和海藻糖在有H5存在时，可通过H5在膜上形成的孔进入细胞内。上述结果表明：H5蛋白可以使海藻糖容易进入真核细胞，进行细胞内玻璃化保存。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-5
符号说明  5-6
正文  6-27
  前言  6-11
  材料与方法  11-17
  结果  17-25
  讨论  25-27
参考文献  27-29
致谢  29-30
攻读学位期间发表的学术论文  30

金黄色葡萄球菌α溶血素基因的克隆、突变和表达及其在细胞玻璃化保存上的初步应用

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