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盾壳霉真菌病毒（CmRV）基因组的分子生物学特性研究

作　者: 程家森
导　师: 姜道宏
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 dsRNA CmRV 真菌病毒
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 293次
引　用: 2次
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内容摘要


盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌，在世界范围内广泛分布，在菌核病的生物防治中有着非常重要的作用。本论文对盾壳霉中的真菌病毒(Coniothyrium minitans RNA virus，CmRV)dsRNA基因组的分子生物学特性进行了研究。通过cDNA克隆和RT-PCR技术获得了该病毒dsRNA基因组的全长序列，共4975个碱基。序列分析表明该病毒仅有一条dsRNA片段，含有两个开放阅读框架(ORF)。ORF1位于该dsRNA的正链上62—2389nt，编码一个分子量为80344Da的外壳蛋白(Coat Protein, CP)；ORF2位于正链上2386—4875nt，编码一个分子量为82511Da的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)；位于2386—2389nt的四个核苷酸AUGA为两个阅读框架所共有，ORF1的终止密码子与ORF2的起始密码子相重叠。根据基因组的组成结构及序列分析，盾壳霉Chy-1菌株中的病毒(CmRV)可以归属于Totiviridae科，CmRV的dsRNA基因组结构和外壳蛋白及RdRp氨基酸序列同源性比较表明该病毒与寄生丝状真菌的Totivirus属的病毒之间的亲缘关系要更为接近。 本文同时还对CmRV的稳定性作了分析。从盾壳霉菌株Chy-1获得了100个单孢分离物，对它们的菌落形态进行了观察，发现在这100个单孢分离物与原始菌株Chy-1之间的菌落形态非常相似，随机挑选32个分离物进行检测，结果表明这些分离物中均含有与Chy-1菌株中大小相同的dsRNA片段。将盾壳霉菌株Chy-1的孢子埋于土壤中，两个月后用菌核为诱饵从土壤中分离到了8个分离物，这8个分离物都具有与Chy-1相似的菌落形态，并可检测到同样的dsRNA片段，Northern杂交证实这些dsRNA片段是CmRV的基因组。以上实验结果说明CmRV可以在盾壳霉稳定存在。 对28个盾壳霉菌株(其中5个菌株来自于英国，3个菌株为Chy-1经紫外线诱变而得)进行dsRNA检测，在其中12个菌株中检测到了dsRNA。Northern杂交结果显示在这12个菌株中的dsRNA病毒相互之间具有一定的同源性，这些病毒有可能属于同一个种，实验结果表明真菌病毒在盾壳霉中有可能普遍存在。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-7
第一章 文献综述  7-17
  1 核盘菌及其作物菌核病  7-9
    1.1 核盘菌的危害  7-8
    1.2 菌核病的防治策略  8-9
  2 盾壳霉的研究进展  9-12
    2.1 盾壳霉生物学特性  9
    2.2 盾壳霉的生态学特性  9-10
    2.3 盾壳霉的遗传多样性  10
    2.4 盾壳霉的寄生特性  10-11
    2.5 盾壳霉的生防前景  11-12
  3 真菌病毒的研究进展  12-16
    3.1 真菌病毒的种类  12-13
    3.2 真菌病的传播  13
    3.3 真菌病毒对寄主的影响  13-15
    3.4 真菌病毒的起源与进化  15-16
  4 研究目的与意义  16-17
第二章 盾壳霉Chy-1菌株dsRNA基因组的cDNA克隆及序列分析  17-38
  1 材料及方法  17-24
    1.1 材料  17-18
      1.1.1 盾壳霉菌株及培养基  17
      1.1.2 细菌菌株及培养基  17
      1.1.3 载体、抗性标记及引物  17
      1.1.4 缓冲液  17-18
      1.1.5 酶、试剂盒及其它试剂  18
    1.2 方法  18-24
      1.2.1 盾壳霉真菌病毒dsRNA的提取  18
      1.2.2 dsRNA的鉴定  18-19
      1.2.3 cDNA的合成  19-20
      1.2.4 cDNA的A-Tailing  20
      1.2.5 特异片段的回收与纯化  20-21
      1.2.6 回收产物与克隆载体连接  21
      1.2.7 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接  21
      1.2.8 重组质粒的筛选、提取及鉴定  21-22
      1.2.9 含特异结构部分序列的克隆  22
      1.2.10 Northern杂交  22-23
      1.2.11 盾壳霉真菌病毒的dsRNA基因组全长序列的分析  23-24
      1.2.12 CmRV的同源性分析  24
  2 结果与分析  24-37
    2.1 盾壳霉真菌病毒dsRNA的提取及鉴定  24
    2.2 随机引物cDNA克隆  24-25
    2.3 Northern杂交  25
    2.4 用特异引物进行RT-PCR合成cDNA  25-26
    2.5 dsRNA末端序列的克隆  26-27
    2.6 含特异结构部分序列的克隆  27
    2.7 盾壳霉真菌病毒的dsRNA基因组全长序列的分析  27-33
    2.8 CmRV编码的CP的氨基酸序列与其它病毒的同源性比较  33-34
    2.9 CmRV编码的RdRp保守区域的聚类分析  34-37
  3 结论与讨论  37-38
第三章 盾壳霉真菌病毒的遗传稳定性及其多样性分析  38-43
  1 材料与方法  38-39
    1.1 菌株及培养基  38
    1.2 盾壳霉菌株的培养  38
    1.3 Chy-1菌株单孢分离物的获得  38
    1.4 Chy-1菌株田间分离物的获得  38-39
    1.5 Chy-1中的病毒向其它菌株的转移  39
    1.6 dsRNA的提取及鉴定见前文  39
    1.7 RNA的斑点杂交  39
  2 结果与分析  39-41
    2.1 各菌株dsRNA病毒的多样性  39-40
    2.2 Chy-1菌株单孢分离物中病毒CmRV的稳定性  40
    2.3 Chy-1菌株中病毒CmRV在田间的稳定性  40
    2.4 Chy-1中的病毒向其它菌株的转移  40
    2.5 RNA的斑点杂交  40-41
  3 结论与讨论  41-43
研究前景展望  43-44
参考文献  44-54
附录1. 在GenBank注册的序列及其登录号  54-57
附录2. 已发表相关文章  57-67
致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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