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志贺菌的多重PCR检测和分子分型研究

作　者: 徐兰英
导　师: 许汴利
学　校: 郑州大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 志贺菌 PCR 毒力基因脉冲场凝胶电泳分型
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
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内容摘要

志贺菌是引起细菌性痢疾的病原体,后者在我国于1985年归为乙类传染病。随着生活水平的提高和管理的加强,其发病率不断下降,但仍远高于发达国家。其致病的强弱、耐药性等与毒力基因有关。毒力基因的检测已作为痢疾常规监测项目之一,对它的研究众多,但多集中在单一PCR,费时费力。分型方法研究众多,但对各种分型方法的比较甚少,尚没有标准的分子生物学分型方法。鉴于此,本实验拟建立一种同时检测志贺菌主要几种毒力基因(setl、sen、ipaH、ial、stxl、virA)的多重PCR;比较几种常用的分型方法,找出一种更适合志贺菌检测的分子生物学方法,为建立标准的检测方法提供建议。方法本实验选取河南省2001～2007年各痢疾监测点分离到的1株痢疾志贺菌、114株福氏志贺菌、11株宋内志贺菌作为研究对象,进行毒力基因的多重PCR建立和检测,并进行重复外回文序列PCR、随机PCR、质粒图谱分型及细菌全基因组脉冲场凝胶电泳,比较它们在溯源和分型应用中的优劣,并对脉冲场凝胶电泳的结果进行聚类分析。结果多重PCR同时检测与单基因PCR分别检测6种毒力基因两种方法具有相近的灵敏度与特异性。毒力基因sen、ipaH、stxl、ial、virA和setlB的阳性率分别为88.70%、99.13%、0、88.70%、92.17%和85.22%,共10种型别。重复外回文序列PCR阳性率96.57%,扩增出0～10条,大小在100～2000bp之间的条带,共三个型别。随机PCR可以很好地对志贺菌进行分型,但很不稳定。质粒图谱分型众多、每次分型效果均很好,但可重复性不太高。脉冲场凝胶电泳将116株志贺菌分为86种不同的带型,可重复性较高。结论对可疑志贺菌临床标本首选多重PCR,对于爆发和聚集性病例首选脉冲场凝胶电泳技术。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-8
前言  8-9
材料与方法  9-21
  1 实验菌株  9
  2 主要试剂  9-10
  3 溶液配制  10-12
  4 主要仪器设备  12-13
  5 生化鉴定方法  13
  6 细菌血清学分型  13
  7 DNA模板的制备  13-14
  8 多重PCR方法检测细菌毒力基因  14-15
  9 重复外回文序列PCR(REP-PCR)  15
  10 随机PCR(RAPD)  15-16
  11 质粒图谱分析  16
  12 脉冲场凝胶电泳实验方法  16-21
结果  21-36
  1 毒力基因多重PCR鉴定结果  21-24
  2 重复外回文序列PCR结果  24-27
  3 随机PCR结果  27-29
  4 质粒图谱分析结果  29-32
  5 脉冲厂凝胶电泳分型及分析结果  32-35
  6 几种分型方法的比较  35-36
讨论  36-40
  1 志贺菌多重PCR反应体系的建立  36-37
  2 重复外回文序列PCR分型  37-38
  3 随机PCR分型  38
  4 质粒图谱分型  38-39
  5 PFGE分型  39
  6 几种方法的比较  39-40
结论  40
参考文献  40-46
志贺菌质粒及其分子生物学研究进展  46-68
  1 侵袭性质粒(与侵袭、扩散有关的质粒)  46-52
  2 毒力质粒(编码毒力基因、抗原等毒力相关的质粒)  52-55
  3 抗性质粒(Resistance plasmid)  55-56
  4 其它功能质粒  56
  5 肠侵袭性病原体毒力的遗传学基础  56-60
  参考文献  60-68
硕士研究生期间发表学术论文  68-69
致谢  69

志贺菌的多重PCR检测和分子分型研究

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