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人参皂苷Rh_2对人肝癌细胞株SMMC-7721诱导分化实验性研究

作　者: 程春
导　师: 王华
学　校: 南通大学
专　业: 普外科
关键词: 人参皂苷Rh2 SMMC-7721 诱导分化实验性
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的研究探讨人参皂苷Rh₂对人肝癌细胞株SMMC-7721 诱导分化作用,从细胞抑制率、细胞周期及亚细胞水平（细胞骨架、细胞间缝隙连接、细胞核骨架-核纤层-中间纤维系统）角度观察其诱导分化发生的机制。为下一步动物试验和研究探索其具体作用机制提供理论的基础和实验依据。方法在体外进行人肝癌细胞株SMMC-7721的培养,并使用10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml人参皂苷Rh₂对其处理2天、4天、6天。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度人参皂苷Rh₂对SMMC-7721肿瘤细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检测不同浓度人参皂苷Rh₂对SMMC-7721肿瘤细胞凋亡的作用。根据MTT及流式细胞仪测定SMMC-7721肿瘤细胞抑制率和凋亡率结果,分析认为人参皂苷Rh₂浓度在20μg/ml及40μg/ml作用时间在4天时对SMMC-7721肝癌细胞有一定的诱导分化作用,故分为20μg/ml、40μg/ml及对照组三组。利用激光共聚显微镜观察对照组、20μg/ml组、40μg/ml组作用4天后SMMC-7721肝癌细胞骨架变化;利用荧光漂白法测定对照组、20μg/ml组、40μg/ml组作用4天后SMMC-7721肝癌细胞间通讯的变化;采用整装电镜的方法观察对照组、20μg/ml组、40μg/ml组作用4天后SMMC-7721肝癌细胞核骨架-核纤层-中间纤维系统的变化。结果1. MTT法检测结果显示人参皂苷Rh₂对SMMC-772肝癌细胞具有生长抑制作用,且其作用与药物的浓度及时间呈依赖关系。其中10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml组作用4天后抑制率达33.2%、42.9%、72.4%;40μg/ml人参皂苷Rh₂作用6天后抑制率达约90%;而对照组细胞生长无明显影响。提示10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml为有效药物浓度,2天、4天、6天为有效作用时间。2.流式细胞仪检测显示人参皂苷Rh₂对SMMC-7721肝癌细胞具有诱导凋亡作用,且细胞凋亡率与药物的浓度作用时间有依赖性关系。对照组及10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml作用4天后细胞凋亡率分别4.99%、6.35%、10.75%、22.42%。其中20μg/ml组、40μg/ml组与对照组比较P<0.05,有统计学意义,而10μg/ml组与对照组比较P>0.05无统计学意义。人参皂苷Rh₂在一定浓度对细胞周期产生影响,但达到一定浓度后其可以致肿瘤细胞死亡率增加,结果表明20μg/ml、40μg/ml作用4天可能SMMC-7721肝癌细胞是理想的诱导分化浓度和时间。3.共聚集显微镜观察人参皂苷Rh₂ 40μg/ml组作用4天后的SMMC-7721细胞骨架结构,可见微丝聚合、重新分布,细胞形态伸展,形成张力纤维,沿长轴分布。而在20μg/ml组作用4天后,可见微丝排列稍紊乱,形成少许张力纤维,分布不太均匀;对照组的细胞则微丝显示紊乱,排列无序,未见张力纤维形成。结果表明人参皂苷Rh₂处理组与对照组有显著性差异性变化。人参皂苷Rh₂在20μg/ml作用4天后可能开始出现肝癌细胞SMMC-7721分化的迹象;而40μg/ml作用4天后细胞可能趋向于成熟分化。4.通过荧光漂白测定不同浓度人参皂苷Rh₂作用于SMMC-7721肝癌细胞后细胞间隙荧光恢复速率。结果显示人参皂苷Rh₂对SMMC-7721肿瘤细胞间通讯有一定的影响。其中对照组、20μg/ml、40μg/ml各组,其作用前后细胞间荧光恢复率分别为11.06±3.87,25.76±9.18,39.34±14.63分别与对照组比较后P<0.05和P<0.01均具有统计学意义,其40μg/ml人参皂苷Rh₂具有显著的统计学意义。表明人参皂苷Rh₂对肝癌细胞株SMMC-7721作用后与对照组细胞间隙荧光恢复速度有差异性改变,这可能是使细胞间隙连接数增加,细胞间通讯的信号增多有关。5.采用整装电镜观察不同浓度人参皂苷Rh₂作用SMMC-7721肿瘤细胞核骨架-核纤层-中间纤维系统。可以发现对照组核仁呈多形性,不规则,电子密度大。核基质由粗细不均匀、分布不规则纤维交织而成。有核纤层介于胞质与核质之间,胞质外中间纤维自核纤层呈不规则放射状,而且有集中趋势;20μg/ml组细胞核仁多为规则,核基质中纤维数理不太明显,胞质中间纤维显著不清,分布不均;而40μg/ml组的核仁规则,多呈单核,核基质中纤维数量多,层次丰富,分布均匀,胞质中出现丰富的中间纤维,规则且均匀分布;。结果表明人参皂苷Rh₂对肝癌细胞株SMMC-7721作用后核骨架-核纤层-中间系统有差异性改变,20μg/ml、40μg/ml组作用后有向成熟分化的趋势。结论人参皂苷Rh₂对SMMC-7721具有一定的诱导分化作用,其作用机制可能与细胞骨架结构、细胞间隙通讯及核骨架-核纤层-中间系统有关。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-13
第一章绪论  13-16
  1.1 课题来源、研究的目的和意义  13-14
  1.2 国内外研究概况  14-15
    1.2.1 国外研究概况  14-15
    1.2.2 国内研究概况  15
  1.3 论文的主要研究内容  15-16
第二章材料与方法  16-25
  2.1 研究资料及仪器设备  16-19
    2.1.1 试剂与仪器  16-17
    2.1.2 研究对象  17
    2.1.3 主要试剂的配法  17-19
  2.2 实验流程与方法  19-25
    2.2.1 细胞培养过程中的主要技术  19-21
    2.2.2 MTT 测定  21
    2.2.3 细胞凋亡率的检测  21-22
    2.2.4 细胞骨架测定  22-23
    2.2.5 荧光光漂白恢复 FRAP（FRAP）判断缝隙连接细胞间通讯( Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能  23
    2.2.6 整装电镜观察细胞细微结构  23-24
    2.2.7 统计学方法  24-25
第三章结果  25-34
  3.1 人参皂苷Rh_2对SMMC-7721 细胞增殖的抑制  25
  3.2 人参皂苷Rh_2对SMMC-7721 细胞凋亡的影响  25-27
  3.3 人参皂苷Rh_2对SMMC-7721 细胞骨架改变  27-29
  3.4 荧光漂白法测定人参皂苷Rh_2对人肝癌细胞株SMMC-7721 细胞间隙连接的影响  29-31
  3.5 整装电镜研究人参皂苷Rh_2诱导人肝癌细胞SMMC-7721 分化过程中细胞核骨架-核纤层-中间纤维系统的变化  31-34
第四章讨论  34-39
第五章结论  39-40
参考文献  40-43
英文缩写词表  43-44
综述  44-53
  综述参考文献  51-53
在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目  53-54
致谢  54

人参皂苷Rh_2对人肝癌细胞株SMMC-7721诱导分化实验性研究

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