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原卟啉钠的制备工艺及其生物活性研究

作　者: 许金鹏
导　师: 李朝品
学　校: 安徽理工大学
专　业: 病原生物学
关键词: 原卟啉钠 血红素 保肝作用 脂质过氧化 SMMC-7721细胞 凋亡 乙型肝炎病毒(HBV) HepG2.2.15细胞
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的优化利用非抗凝猪血制备原卟啉钠(NAPP)的工艺,在此基础上研究NAPP对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制和体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用及体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。方法先以非抗凝猪血为原料提取出血红素,再由血红素经原卟啉二甲酯直接制得NAPP;利用紫外—可见吸收光谱与红外光谱对提取的血红素和制备的NAPP进行定性检测,并利用紫外分光光度法对二者进行定量检测并计算纯度；通过单因素试验和正交试验2种方法对利用非抗凝猪血制备NAPP的工艺进行优化,确定最佳工艺参数。60只ICR小鼠随机分为正常对照组、CCl4模型组、联苯双酯组、NAPP低、中、高剂量组,每组10只；各治疗组每天灌胃给予联苯双酯(200 mg/kg)或不同剂量(30,60,120 mg/kg)的NAPP,连续10 d后,一次性腹腔注射CCl4(60 mg/kg)建立急性肝损伤模型；16h后,各组小鼠摘眼球取血测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力；剖腹取肝,称重,计算肝脏指数；制备肝组织匀浆测定过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,并观察肝组织病理学变化。通过对人正常肝细胞株QSG-7701细胞的药物毒性实验筛选NAPP对人正常肝细胞无明显毒性的最大无毒浓度(TC0)；以TC0为起始浓度,10倍梯度稀释成5个不同的NAPP浓度,作用于体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,采用MTT法测定NAPP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用；经倒置显微镜和Hoechst 33258染色倒置荧光显微镜进行形态学观察,计数凋亡细胞,并计算凋亡指数(AI)；流式细胞术测定SMMC-7721细胞的细胞周期分布和凋亡、坏死率。以不同浓度NAPP作用于体外培养的HepG2.2.15细胞4d后,采用MTT法、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)和联免疫吸附试验(ELISA)探讨NAPP对HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用及其分泌HBsAg.HBeAg.前S1抗原(Pre-S1Ag)的影响；通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测NAPP对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV-DNA复制的抑制作用。结果优化了以非抗凝猪血为原料制备NAPP的工艺,1 kg非抗凝猪血平均可以提取出10.6 g血红素,每5g血红素平均可以制得3.46 gNAPP；经检测,提取的血红素纯度达90.8%,制备的NAPP纯度为88.8%；经单因素试验和正交试验,提取血红素时,确定的最佳提取工艺为：匀浆5 min,匀浆后加入等体积双蒸水,V盐酸丙酮:V溶血液=5:1,搅拌抽提10 min；制备NAPP时,确定的最佳制备工艺是：酯化时甲醇用量为70 mL,皂化时氢氧化钠甲醇溶液用量为80 mL,90℃加热回流2.0h。与CCl4模型组比较,各治疗组小鼠肝脏指数、血清ALT和AST活性不同程度降低(P<0.05,P<0.01),肝组织匀浆中CAT、GSH-Px、SOD活力不同程度升高(P<0.05, P<0.01),MDA含量不同程度降低(P<0.05,P<0.01)；病理切片也表明,NAPP各治疗组小鼠肝损伤不同程度减轻,其中高剂量组肝损伤程度最轻。不同浓度NAPP作用后,SMMC-7721细胞的增殖明显受到抑制,OD值明显降低(P<0.05或P<0.01),且抑制率高低与浓度和作用时间呈一定的依赖性；光学显微镜下见细胞个数明显减少,细胞密度明显变稀,细胞形态发生了明显变化,很多细胞间的连接消失,细胞变圆、皱缩或见细胞外形变长呈长梭形；荧光显微镜下细胞呈典型的凋亡形态学改变,AI显著升高(P<0.05或P<0.01)；经流式细胞仪检测,可见SMMC-7721细胞凋亡率不同程度升高,细胞周期被阻滞于G2/M期。NAPP在0.01～100μg/mL浓度范围内对HepG2.2.15细胞没有明显的细胞毒性作用,半数毒性浓度(TC50)为4654μg/mL; NAPP在0.01-100μg/mL浓度范围内,对HepG2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg、HBeAg和Pre-S1Ag及HBV-DNA均有一定的抑制作用,其对四者的治疗指数(TI)也分别为119、27、19和83。结论优化了从非抗凝猪血制备NAPP的工艺,该制备工艺切实可行,具有操作简便,原料易得,制备周期短,成本低,产量较高,是一种较理想的制备NAPP方法,为充分利用我国丰富的猪血资源提供了切实可行的技术路线。一方面,NAPP可能通过阻止抗氧化酶活性降低和抗脂质过氧化作用的途径对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。另一方面,NAPP对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞具有一定的增殖抑制和促进凋亡的作用。此外,NAPP在体外也具有一定的抗HBV作用。图[27]表[25]参[80]

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
插图清单  14-15
附表清单  15-16
注释说明清单  16-18
引言  18-20
第1章 原卟啉钠的研究进展  20-26
  1.1 原卟啉钠的结构与性质  20-21
  1.2 原卟啉钠的制备方法  21-22
  1.3 卟啉化合物的分离纯化方法  22
  1.4 原卟啉钠的生物活性和药理作用  22-25
  1.5 结语与展望  25-26
第2章 非抗凝猪血制备原卟啉钠的工艺及其优化研究  26-54
  2.1 非抗凝猪血提取血红素的工艺及其优化研究  26-40
    2.1.1 前言  26
    2.1.2 材料与方法  26-29
    2.1.3 结果  29-38
    2.1.4 讨论  38-40
  2.2 原卟啉钠的制备工艺及其优化研究  40-54
    2.2.1 前言  40
    2.2.2 材料与方法  40-43
    2.2.3 结果  43-53
    2.2.4 讨论  53-54
第3章 原卟啉钠对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制研究  54-64
  3.1 前言  54
  3.2 材料与方法  54-56
  3.3 结果  56-61
  3.4 讨论  61-64
第4章 原卟啉钠体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用  64-80
  4.1 前言  64
  4.2 材料与方法  64-70
  4.3 结果  70-78
  4.4 讨论  78-80
第5章 原卟啉钠抗乙型肝炎病毒的体外实验研究  80-94
  5.1 前言  80
  5.2 材料与方法  80-85
  5.3 结果  85-91
  5.4 讨论  91-94
结论  94-96
参考文献  96-102
附录 附图(实验照片)  102-104
致谢  104-106
作者简介及读研期间主要科研成果  106

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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