学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

RNAi技术干扰Hep-2细胞PTTG1基因的初步研究

作　者: 徐桂超
导　师: 王云龙
学　校: 河南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Hep-2细胞 RNA干扰 PTTG1基因
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 50次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


肿瘤是与多基因、多因素相关的疾病,大多数肿瘤的发生与原癌基因的突变、过度表达以及抑癌基因的突变、失活相关。抑制肿瘤相关基因的表达一直是研究新型抗肿瘤方法的重要思路。RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象发现于1995年,是在转录后水平沉默相应基因表达的基因阻断新技术,是近几年基因治疗的热点。RNAi技术的原理是小干扰RNA（siRNA）利用碱基互补的原理,引导RNA诱导的沉默复合物（RISC）特异性识别并结合目的基因的mRNA,引发mRNA降解,抑制肿瘤相关蛋白质的生成,诱使肿瘤细胞凋亡或使其向成熟方向分化,从而抑制肿瘤增殖。垂体瘤转化基因（PTTG）在正常细胞的增殖、分化及凋亡过程中起重要作用。研究表明,PTTG1基因的高表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。利用RNAi技术沉默人喉癌Hep-2细胞中PTTG1基因的表达,阻止或延缓肿瘤细胞的生长具有现实意义和潜在的临床应用价值。本研究根据GenBank中登录的人PTTG1基因mRNA序列（NM004219.2）,利用美国Applied Biosystems公司提供的siRNA在线设计软件筛选了针对mRNA序列上2个不同靶位点的2对互补DNA单链,分别稀释为相同浓度后将互补单链分别等量混匀,退火为双链DNA分子,分别命名为PTTG1a和PTTG1b。两双链DNA分子5’端和3’端分别带有EcoRⅠ、BamHⅠ黏性末端。真核表达质粒载体plk0.1-puro经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后,回收6312bp的大片段,与PTTG1a和PTTG1b分别连接,构建了表达短发夹RNA（shRNA）的2种重组质粒。经双酶切鉴定和测序鉴定,2种重组质粒构建成功,分别命名为plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b。提质粒并经分光光度计测定,表明两种重组质粒溶液的纯度均较高,可应用于转染实验。同时,将嘌呤霉素稀释为8种不同浓度,加入到培养的人喉癌Hep-2细胞系,持续培养14d,观察嘌呤霉素对细胞存活的影响。重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b均稀释为不同浓度,在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染Hep-2细胞系,用嘌呤霉素筛选,于转染12d后收集细胞,分别提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测PTTG1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随质粒浓度的增加,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;6孔板中每孔转染1000ng、1200ng质粒时,plk0.1-puro/PTTG1a对PTTG1基因的抑制率可达70%以上,plk0.1-puro/PTTG1b的抑制率则低于20%。故后续实验以plk0.1-puro/PTTG1a进行操作。同一浓度（1000ng/孔）的重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a在脂质体介导下转染培养于6孔板的Hep-2细胞系,经嘌呤霉素筛选后,分别在转染后7d、12d、18d收集细胞,提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,分别以RT-PCR、Western blot技术检测PTTG1基因mRNA、蛋白质相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随时间的延长,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;转染超过12d时,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。一般,对目的基因的抑制效率达到70%以上的siRNA序列具有较好的应用前景。本实验构建的重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a,在六孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,人喉癌Hep-2细胞内PTTG1 mRNA和蛋白质相对表达水平降低了70%以上,有效抑制了PTTG1基因的表达,故重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a在关于PTTG1基因的研究中具有较好的应用价值。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
符号与缩略语  13-15
前言  15-29
  1 RNA 干扰技术  15-25
    1.1 RNA 干扰现象的发现  15-16
    1.2 siRNA 介导的RNAi 作用机制  16-19
      1.2.1 siRNA 的产生  16
      1.2.2 RISC 的组装  16-17
      1.2.3 切割目的mRNA  17-18
      1.2.4 RNAi 的放大效应  18-19
    1.3 RISC 的关键组分  19-21
      1.3.1 Dicer 酶  19
      1.3.2 siRNA  19-20
      1.3.3 Argonaute 蛋白家族  20-21
      1.3.4 其他大分子  21
    1.4 siRNA 设计规则研究  21-22
    1.5 siRNA 的在线设计  22-23
    1.6 siRNA 的制备方法  23
    1.7 siRNA 表达载体  23-24
    1.8 RNAi 的应用  24-25
  2 PTTG1 基因的生物学特性  25-28
    2.1 PTTG1 基因的表达特性  25-26
    2.2 PTTG1 基因的功能  26-28
      2.2.1 PTTG1 与姐妹染色单体的分离  26
      2.2.2 PTTG1 与细胞周期调控  26-27
      2.2.3 PTTG1 与肿瘤的发生  27-28
  3 研究目的与意义  28-29
材料与方法  29-55
  1 材料  29-40
    1.1 载体  29
    1.2 受体菌  29
    1.3 细胞系及细胞培养  29-30
    1.4 引物和测序  30
    1.5 主要仪器与设备  30-31
    1.6 主要试剂  31-32
    1.7 主要溶液的配制  32-40
  2 方法  40-55
    2.1 RNA 干扰位点的选择和siRNA 表达序列的确定  40-41
      2.1.1 RNA 干扰位点的选择  40
      2.1.2 siRNA 序列的选择  40
      2.1.3 shRNA 表达序列的确定  40-41
    2.2 PTTG1 基因RNAi 质粒的构建  41-45
      2.2.1 DNA 单链的退火  41
      2.2.2 碱裂解法提取质粒  41-42
      2.2.3 EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切plk0.1-puro 质粒载体  42
      2.2.4 胶回收酶切成功的质粒  42-43
      2.2.5 重组质粒的构建  43
      2.2.6 制备大肠杆菌DH5α感受态细胞  43
      2.2.7 重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞  43-44
      2.2.8 阳性克隆的筛选与鉴定  44-45
      2.2.9 质粒纯度和浓度测定  45
      2.2.10 质粒的无菌化处理  45
    2.3 嘌呤霉素对细胞存活的影响  45-46
      2.3.1 复苏培养Hep-2 细胞  45-46
      2.3.2 嘌呤霉素对细胞存活的影响  46
    2.4 不同质粒浓度的干扰效果  46-51
      2.4.1 细胞预培养  46-47
      2.4.2 不同浓度的质粒转染  47-48
      2.4.3 嘌呤霉素筛选  48
      2.4.4 细胞形态学观察  48
      2.4.5 RT-PCR 检测干扰效率  48-50
      2.4.6 Western Blot 凝胶电泳检测蛋白表达  50-51
    2.5 比较不同干扰时间的抑制率  51-55
      2.5.1 细胞的预培养和转染  52
      2.5.2 嘌呤霉素筛选  52
      2.5.3 RT-PCR 检测干扰效率  52-53
      2.5.4 Western blot 检测干扰效率  53-55
结果  55-67
  1 siRNA 序列的设计与筛选  55
  2 DNA 单链的退火结果  55-56
  3 EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切plk0.1-puro 质粒载体  56
  4 EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒  56-57
  5 测序鉴定重组质粒  57
  6 质粒浓度和纯度测定  57-58
  7 嘌呤霉素对Hep-2 细胞存活的影响  58
  8 细胞形态学观察结果  58-59
  9 基因抑制效率的检测  59-67
    9.1 引物设计  59
    9.2 不同浓度质粒干扰效率的检测结果  59-63
      9.2.1 RT-PCR 检测PTTG1 mRNA 相对表达水平  59-61
      9.2.2 Western blot 检测PTTG1 蛋白的相对表达水平  61-63
    9.3 plk0.1-puro/PTTG1a 不同作用时间干扰效率的检测结果  63-67
      9.3.1 RT-PCR 检测PTTG1 mRNA 的相对表达水平  63-64
      9.3.2 Western blot 检测 PTTG1 蛋白的相对表达水平  64-67
讨论  67-71
  1 RNA 干扰技术的优势  67
  2 干扰位点的选择  67-68
  3 影响转染效率的因素  68-69
  4 干扰效率的评价  69-71
结论  71-73
参考文献  73-82
附录 A plk0.1-puro/PTTG1a 和 plk0.1-puro/PTTG1b 测序结果  82-83
附录 B Hep-2 细胞形态观察  83-84
致谢  84-85
攻读学位期间发表的学术论文目录  85-86

相似论文

  1. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  2. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  3. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  4. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  5. 灰飞虱功能基因的克隆及其RNAi致死效应,S435.112.3
  6. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  7. 脂质体介导的VEGF-C siRNA治疗肺癌体外实验研究,R734.2
  8. 新型拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤活性及其机制研究,R96
  9. RNA干扰靶向沉默STAT1基因对宫颈癌细胞Hela生物学特性的影响,R737.33
  10. SOCS1沉默增强树突状细胞抗喉癌免疫效应,R739.65
  11. mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰对大肠癌细胞杀伤效率的研究,R735.34
  12. 黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族的克隆及其RNAi载体的构建,S543.6
  13. 抗菌肽Selysin的表达及其对肝癌细胞HepG2的毒性作用,R735.7
  14. 鸡骨骼肌硒蛋白W对不同硒水平的响应及其功能初探,S831.5
  15. HMGB1与宫颈癌转移的相关性研究,R737.33
  16. siRNA抑制PPARγ的表达对绒癌细胞JEG-3侵袭力的影响,R737.33
  17. 5-氟胞嘧啶热化疗对裸鼠肝癌治疗机理研究,R735.7
  18. siRNA靶向沉默CXCR4基因对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭力的影响,R737.31
  19. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在卵巢癌靶向治疗中的作用研究,R737.31
  20. 板栗疫病菌RNA干扰系统的建立,S436.64

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
© 2012 www.xueweilunwen.com