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野黄芩苷对人牙周膜细胞保护作用的实验研究

作　者: 杨宁
导　师: 王春艳；葛志华
学　校: 承德医学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 野黄芩苷人牙周膜细胞内毒素细胞增殖细胞周期碱性磷酸酶肿瘤坏死因子α 基质金属蛋白酶
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:人牙周膜细胞作为牙周组织的基础细胞,在牙周组织的再生和修复中发挥着重要作用。本课题旨在探讨黄芩茎叶提取物-野黄芩苷对牙周膜细胞的保护作用,为野黄芩苷应用于临床治疗牙周病提供理论和实验依据。方法:1无菌取青少年因正畸拔除的健康牙,体外原代培养牙周膜细胞,免疫细胞化学方法鉴定细胞来源。2实验分组及干预:分为正常对照组、LPS干预组、不同浓度野黄芩苷+LPS干预组。正常对照组用2% FBS的DMEM培养液培养牙周膜细胞;LPS组用100μg/ml的LPS处理细胞;野黄芩苷+LPS组分别用0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的野黄芩苷和100μg/ml的LPS处理细胞。3采用四唑盐比色(MTT)方法,观察野黄芩苷对LPS作用的人牙周膜细胞增殖活性的影响。4采用流式细胞技术观察野黄芩苷对LPS作用的人牙周膜细胞的细胞周期的影响。5采用酶动力学方法观察野黄芩苷对LPS抑制人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性的作用。6采用酶联免疫方法(ELISA)检测人牙周膜细胞培养上清液中的TNF-α水平。7采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测人牙周膜细胞MMP-1、MMP-2的表达情况。8数据处理采用SPSS11.5统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验, P < 0.05表示差异有统计学意义。结果:1体外培养牙周膜细胞成功后,对第三代细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,显示细胞波形丝蛋白阳性、角蛋白染色阴性,确定为牙周膜细胞。2野黄芩苷对牙周膜细胞增殖活性的影响LPS干预组牙周膜细胞24h、48h、72h与相应同期正常对照组相比,牙周膜细胞增殖活性均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),说明100μg/ml LPS能明显抑制牙周膜细胞的增殖活性。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度的野黄芩苷干预后,与LPS组相比,0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞24h;0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞48h; 0.1μg/ml、1μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞72h时,牙周膜细胞增殖活性增加,差异具有统计学意义(P < 0.05,P < 0.01),提示野黄芩苷具有拮抗LPS抑制牙周膜细胞增殖活性的作用。3野黄芩苷对牙周膜细胞的细胞周期影响牙周膜细胞经100μg/ml LPS处理24h,G0/G1期、S期、G2M期细胞所占百分比分别与正常对照组的对应时相相比有所不同,但差异无统计学意义(P > 0.05)。同时段加入1μg/ml浓度野黄芩苷后,G0/G1期所占百分比降低,而G2M期所占百分比和增殖指数(Prl值)明显升高,与LPS组比较,差异具有统计学意义(P < 0.05)。4野黄芩苷对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响100μg/ml LPS处理牙周膜细胞72h,与正常对照组相比,ALP活性显著受到抑制(P < 0.01)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷后,在较低浓度0.001μg/ml、0.01μg/ml时作用不明显,0.1μg/ml对LPS抑制ALP活性已有明显的拮抗作用(P < 0.05),在1μg/ml时拮抗作用达到高峰(P < 0.01)。5野黄芩苷对牙周膜细胞分泌TNF-α的影响正常对照组的牙周膜细胞分泌较低水平的TNF-α。经100μg/ml LPS处理24h,牙周膜细胞分泌TNF-α水平提高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷,各浓度的野黄芩苷对LPS刺激TNF-α分泌均有显著的抑制作用(P < 0.01),其中在野黄芩苷浓度1μg/ml时抑制作用达到最大,并且与较低浓度0.001μg/ml、0.01μg/ml野黄芩苷组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。6野黄芩苷对牙周膜细胞MMP-1、MMP-2蛋白表达的影响6.1 MMP-1蛋白表达的结果Western-Blot检测显示:HPDLCs经100μg/ml的LPS处理24h后,MMP-1蛋白表达量比正常对照组有所增多,但差异无统计学意义(P>0.05)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷后,随着药物浓度的增加,MMP-1蛋白表达量有减少趋势,但与LPS组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。6.2 MMP-2蛋白表达的结果Western-Blot检测显示:正常对照组HPDLCs表达较低水平的MMP-2蛋白,100μg/ml的LPS处理HPDLCs 24h,MMP-2蛋白表达量增多,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.05)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷,MMP-2蛋白表达有所减少,但仅在10μg/ml野黄芩苷组,与LPS组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:1 100μg/ml LPS抑制牙周膜细胞的增殖和碱性磷酸酶活性,诱导牙周膜细胞的TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表达。2加入不同浓度的野黄芩苷能拮抗LPS对牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的抑制作用,并且能抑制TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表达。3本研究结果提示,野黄芩苷对人牙周膜细胞有保护作用。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
英文缩写  12-13
研究论文野黄芩苷对人牙周膜细胞保护作用的实验研究  13-58
  前言  13-15
  材料与方法  15-26
  结果  26-29
  附图  29-43
  附表  43-46
  讨论  46-52
  结论  52-53
  参考文献  53-58
综述  58-67
  参考文献  64-67
致谢  67-68
个人简历  68

野黄芩苷对人牙周膜细胞保护作用的实验研究

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