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肝素酶siRNA对肝癌细胞生长抑制作用的研究及抗人肝素酶单克隆抗体的制备

作　者: 刘至玄
导　师: 宫锋
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 肝素酶 RNAi 肝癌单克隆抗体
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

肝素酶(Heparanase，HPA)是一种β-葡萄糖苷内切酶，特异性降解细胞外基质和血管基底膜中硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)的降解，破坏组织和血管的完整性，释放结合于硫酸肝素上的bFGF、VEGF等生物活性分子，与肿瘤转移密切相关，近年来成为肿瘤诊断和治疗的重要研究对象。本实验采用RNA干扰(RNAi)技术研究肝素酶与肿瘤生物学行为的关系。通过肝素酶siRNA抑制肝癌细胞HepG2中肝素酶的表达，得到了肝素酶低表达的HepG2细胞株。采用流式细胞术、western blot、RT-PCR、免疫组化等方法对细胞鉴定的结果表明，实验组肝癌细胞肝素酶基因和蛋白表达明显降低；将实验组和对照组细胞接种裸鼠皮下所获得的成肿瘤数据表明，实验组成瘤速度明显减缓、瘤重下降；肿瘤组织的免疫组化结果显示，对照组肿瘤组织肝素酶呈强阳性，实验组呈弱阳性。实验结果验证了肝素酶在肿瘤生长过程中的重要作用，提示RNAi技术对肝素酶表达及成瘤性具有抑制效果，说明RNA干扰技术用于临床肿瘤的治疗具有很大的潜力。采用抗原优势表位的预测、合成肝素酶优势抗原多肽，用杂交瘤技术制备了能够稳定分泌抗人肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用western blot和免疫组化方法进行鉴定抗体特性，结果显示所生产的单克隆抗体可以特异性识别人肝素酶，能够反映组织内的肝素酶含量，可以用于对肿瘤组织细胞内肝素酶水平的分析。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-7
引言  7-11
  1.1 硫酸肝素、肝素酶概述  7-8
  1.2 肝素酶基因分子生物学特征  8
  1.3 肝素酶与肿瘤的发生与发展的关系  8-10
  1.5 肝素酶与恶性肿瘤的诊断与治疗  10
  1.6 小结  10-11
第一章肝素酶siRNA对肝癌细胞生长的抑制作用  11-23
  1 背景  11
  2 材料与方法  11-16
    2.1 材料  11-12
    2.2 方法  12-16
  3 实验结果  16-22
    3.1 siRNA序列;pGCsciencerTM U6/Neo/GFP/RNAi载体和质粒图谱  16
    3.2 FITC-Hpa siRNA1-3瞬时转染  16-17
    3.3 RNA干扰效果检测  17
    3.4 siRNA表达稳定性分析  17-18
    3.5 RNA干扰对肝素酶基因表达水平的影响  18-19
    3.6 RNA干扰对肝素酶蛋白表达水平的影响  19
    3.7 荷瘤小鼠瘤重量、体积测量  19-22
    3.8 免疫组化检测结果  22
  4 讨论  22-23
第二章抗人肝素酶单克隆抗体的制备  23-31
  1 背景  23
  2 材料与方法  23-27
    2.1 材料  23-24
    2.2 方法  24-27
  3 结果  27-30
    3.1 优势抗原表位计算  27
    3.2 合成多肽的色谱图  27-28
    3.3 免疫小鼠血清效价测定  28
    3.4 Western blot对抗体的免疫识别特性检测  28
    3.5 抗体纯化及效价  28-29
    3.6 免疫组化结果  29-30
  4 讨论  30-31
参考文献  31-33
综述及在学期间发表的论著  33-44
致谢  44-45
附:研究报告  45-50

肝素酶siRNA对肝癌细胞生长抑制作用的研究及抗人肝素酶单克隆抗体的制备

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