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基于候选基因的肝癌、鼻咽癌和脓毒症的遗传关联研究

作　者: 虞立霞
导　师: 周虹; 宫锋; 周钢桥
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝素酶单核苷酸多态性肝癌鼻咽癌遗传关联研究炎症性caspase 脓毒症病例-对照研究
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

第一章:背景和目的:肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国常见的两种恶性肿瘤,是环境因素和机体遗传因素交互作用并经多阶段发展而产生的。目前这两种肿瘤的诊疗存在早期诊断困难、复发转移率高、预后差等问题,因此对其发病机制的研究具有重要意义。恶性增殖和转移侵袭是这两种肿瘤预后差的主要原因,肝素酶(heparanase, HPA)作为一种糖苷内切酶,在此过程中充当着重要角色。肝素酶能够降解糖侧链硫酸肝素(heparan sulfate, HS),破坏细胞外基质的天然屏障,促进肿瘤的恶性增殖和转移侵袭。临床病理学研究显示肝素酶在肝癌组织中高表达,且与鼻咽癌病人的预后相关。除此之外动物模型实验表明,过表达的肝素酶可以加速硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的代谢更新,使结合于侧链HS上的生长因子得以释放,进而参与肿瘤血管形成、转移侵袭等过程。大量遗传关联研究提示,宿主的遗传因素是决定不同个体间肿瘤易感性差异的基础。由此,推测肝素酶基因多态性可能会通过影响基因本身的功能而影响到个体间肝癌、鼻咽癌易感性的差异。为此,本研究首次在肝癌、鼻咽癌病例和对照人群中系统考察了肝素酶基因多态性与肝癌、鼻咽癌易感性的关联。方法:在招募自中国东南部肝癌和鼻咽癌高发区的400例HCC患者、855例NPC患者和1036例正常对照人群中,采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)和SNPstream基因分型方法对肝素酶基因( heparanase gene, HPSE )上的6个标签SNPs(haplotype-tagging SNP, htSNP)进行了分型。在控制混杂因素的条件下,以非条件性Logistic回归模型计算基因型与肝癌、鼻咽癌易感性的相关性。结果:在非HBV携带者中,HPSE rs12331678多态性位点与肝癌的易感性显著相关,携带A等位的个体显著增加了肝癌的患病风险【校正的比值比(odds ratio, OR),2.19;95%置信区间(confidence interval, CI),1.25-3.85;P = 0.0074】。经过多重检验校正后,P = 0.0074×5 = 0.037,仍然具有显著的统计学意义。进一步对各种混杂因素进行分层分析发现,混杂因素对rs12331678基因型的遗传学效应没有显著的修饰作用。然而,关联研究显示肝素酶基因多态性与NPC的易感性及病程进展均不存在统计学意义上的遗传学关联。结论:通过对中国人群中肝素酶基因多态性与肝癌、鼻咽癌遗传易感性的研究,我们发现肝素酶基因可能是肝癌的一个易感基因,这可能为肝癌的人群预防提供一个新的遗传标记。第二章:背景和目的:脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身性炎症反应综合征,是创伤、烧伤、术后感染和危重病的常见并发症,是急危重病学面临的突出难题,寻找能够预警脓毒症发生、病程进展和预后的有效指标一直是亟需解决的重要科学问题。炎症的失衡导致脓毒症病人进一步发展成为严重脓毒症、脓毒性休克、器官功能衰竭、死亡、二次感染等。炎症复合体(inflammasomes)作为一类细胞内的模式识别受体,能够识别侵入细胞内的病原体,并激活炎症性半胱氨酸蛋白酶(inflammatory caspases,包括CASP1、CASP4、CASP5和CASP12,其基因成簇位于11q22.3基因组区域),进而调节促炎症性因子的成熟活化,在脓毒症发生发展过程中发挥着重要作用。大量研究显示,宿主的易感性能够影响脓毒症的发生及进展,基因多态性作为个体间性状差异的遗传基础,可以诠释宿主的易感性。在感染过程中,炎症性caspase基因多态性可以影响下游通路中相关炎症因子的过度反应或低反应性,进而影响脓毒症病人的预后和临床转归。鉴定这些遗传风险因素,可以为脓毒症的早期预防和风险预测提供新的遗传标志物,并为临床治疗提供合理的靶标。方法:我们共招募了2个独立的脓毒症病例-对照人群,分别来自中国的大连(299病例和299对照)和郑州(255病例和260对照)。利用SNPstream分型方法,对11q22.3基因簇区域上的34个标签SNP位点进行基因分型。在控制混杂因素的条件下,以非条件性Logistic回归模型计算基因型与脓毒症发生风险及病程进展的关联。采用报告基因实验,检测不同等位对基因转录活性的影响。结果:加性遗传模型下,校正性别、年龄、吸烟、饮酒、慢性病、APACHEII评分和病因因素,我们发现rs506601 T等位是风险等位,能够增加脓毒症患者的死亡风险(大连人群:OR = 6.83,95% CI = 1.63-28.67,P = 0.011;郑州人群:OR = 5.39,95% CI = 1.03-28.11,P = 0.05;合并人群:OR = 4.58,95% CI = 1.61-13.07,P = 0.0059),且与荧光素酶的低活性相关联,由此可推知,T等位能够导致中国人群中CASP12截短型蛋白的表达水平降低。结论:本研究首次揭示11q22.3区域基因多态性与脓毒症的易感性相关联,位于启动子区的rs506601多态性位点能够调节CASP12基因的表达,从而影响相关炎症性因子的表达,进而导致脓毒症预后的差异性。11q22.3基因簇区域可能是脓毒症的一个易感区域,这一结果仍需要在不同种族人群中进行重复验证。

全文目录

主要英文缩写一览表  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
前言  13-17
  参考文献  16-17
第一章肝素酶基因多态性与肝癌、鼻咽癌的遗传关联研究  17-54
  前言  17-18
  1.1 实验材料与方法  18-28
    1.1.1 研究人群  18
    1.1.2 仪器设备  18-19
    1.1.3 实验试剂  19-20
    1.1.4 实验方法  20-27
      1.1.4.1 候选SNPs 的选取  20
      1.1.4.2 基因分型实验  20-27
      1.1.4.3 实时定量PCR 实验  27
      1.1.4.4 免疫组化实验  27
    1.1.5 统计学分析  27-28
  1.2 实验结果  28-48
    1.2.1 入选样本的社会人口学资料及临床特征  28-31
    1.2.2 候选SNPs 的确定  31-32
    1.2.3 候选SNPs 的分型结果  32-36
      1.2.3.1 PCR-RFLP 分型结果  32-33
      1.2.3.2 SNPstream 分型结果  33-36
    1.2.4 关联分析结果  36-47
      1.2.4.1 肝素酶与肝癌易感性的关联分析  36-40
      1.2.4.2 肝素酶与鼻咽癌易感性及病程进展的关联分析  40-47
    1.2.5 实时定量PCR 结果  47-48
    1.2.6 免疫组化结果  48
  1.3 讨论  48-54
第二章炎症性caspase 基因多态性与脓毒症的遗传关联研究  54-93
  前言  54-56
  2.1 实验材料与方法  56-66
    2.1.1 研究人群的招募  56-57
    2.1.2 仪器设备  57
      2.1.2.1 基因分型实验设备  57
      2.1.2.2 功能实验仪器设备  57
    2.1.3 实验试剂  57-58
      2.1.3.1 分型实验试剂  57
      2.1.3.2 功能实验试剂  57-58
      2.1.3.3 试剂配置  58
    2.1.4 实验方法  58-65
      2.1.4.1 血液中基因组DNA 的提取（酚-氯仿法）  58-59
      2.1.4.2 标签SNPs 的选取  59
      2.1.4.3 基因分型  59-62
      2.1.4.4 报告基因实验  62-65
    2.1.5 统计学分析  65-66
  2.2 实验结果  66-88
    2.2.1 入选样本的社会人口学资料及临床特征  66-68
    2.2.2 标签SNPs 的确定  68-70
    2.2.3 标签SNPs 的SNPstream 分型结果  70-71
    2.2.4 关联分析结果  71-81
      2.2.4.1 SNPs 与脓毒症发生风险的关联分析结果  71-76
      2.2.4.2 SNPs 与脓毒症病程进展的关联分析结果  76-81
    2.2.5 单体型分析  81-82
    2.2.6 独立性检验  82-84
    2.2.7 功能性的病因性SNP 的搜寻  84-87
    2.2.8 报告基因实验结果  87-88
  2.3 讨论  88-93
全文结论  93-94
附录  94-114
个人简历  114-115
致谢  115-117
文献综述  117-120

基于候选基因的肝癌、鼻咽癌和脓毒症的遗传关联研究

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