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两株土壤放线菌抗肿瘤活性代谢产物的分离纯化及活性研究

作　者: 黄麟
导　师: 张庆林
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物化学
关键词: 土壤放线菌 筛选 发酵 分离 结构鉴定 抗肿瘤活性
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的：在过去的研究工作中，我们建立了一套适合大量微生物的筛选，发酵，代谢物的提取，分离方法，并对我国边远地区收集的土壤微生物进行了筛选。以Vero（非洲绿猴肾细胞）细胞为正常对照细胞，以K562细胞为靶细胞筛选对正常细胞／肿瘤细胞具有选择性抑制作用的代谢物，通过筛选发现，放线菌（Streptomyces sp．3423）的代谢产物提取物对K562细胞具有抑制活性(IC50=25.12μl／ml)，但对Vero细胞呈弱抑制活性，具有选择性抑制作用。放线菌（Streptomyces sp．2215）的代谢产物提取物对格列卫耐药K562／Glc细胞具有抑制作用(IC50=18.04μl／ml)，且对Vero细胞呈弱抑制活性，具有选择性抑制作用。从筛选结果得知，这两株放线菌代谢产物中均含有抗肿瘤成分，但具体的化合物未知，本文对其进行了分离纯化及结构鉴定，并对分离得到的化合物进行了体外抗肿瘤活性及抗肿瘤机制的相关研究，以期发现抗肿瘤先导化合物。方法：放线菌（Streptomyces sp．3423）和放线菌（Streptomyces sp．2215）分别采用摇瓶和发酵罐发酵的方法进行菌种大规模发酵，发酵液采用溶剂提取法进行有效成分的提取，提取物采用正相硅胶柱色谱，反相C18柱色谱，Sephadex LH-20，制备TLC，HPLC等系统分离的手段进行分离得到单体化合物，化合物采用IR，FAB-MS，1H-NMR，13C-NMR，1H-1HCOSY，HSQC，HMBC等手段进行结构鉴定。分离得到的化合物采用MTT法进行体外K562细胞抑制活性测定，Western-blot法检测化合物对BCR-ABL蛋白表达的抑制作用。结果：从3423#放线菌中分离得到6个已知化合物，其中五个为环二肽类物质，经鉴定分别为：1：（Z，Z）6-亚异丁基-3-苯亚甲基-1-N-甲基-哌嗪-2，5-二酮，2：3-苄基-6异丁基--哌嗪-2，5-二酮，3：：（Z）3-苯亚甲基-6异丁基--哌嗪-2，5-二酮，4：（Z）3-苄基-6亚异丁基--哌嗪-2，5-二酮，5：（Z，Z）6-亚异丁基-3-苯亚甲基-哌嗪-2，5-二酮（白诺菌素），6：6-甲基-3-羟基-5-甲氧基-2.3-二氢吡喃-4酮；从2215#放线菌中分离得到3个已知化合物，其中两个为醌霉素类物质，一个为脂肪酸类物质，经鉴定结构分别为：7：monosulfoxide quinomycine，8：quinomycine A，9：十六烷酸；生物学研究表明，化合物1，5，7，8均对K562细胞具有抑制活性，其IC50值分别为13.8μg／ml，4.05μg／ml，34.01ng／ml，0.015ng／ml，Western-blot结果表明，化合物5，7，8对BCR-ABL融合蛋白的表达有抑制作用，化合物对K562细胞的抑制活性及作用机制均未见报道。

全文目录


缩略语索引  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-17
第一部分 土壤放线菌代谢物体外活性筛选  17-21
  1.1 材料与方法  17-18
    1.1.1 仪器与试剂  17
    1.1.2 供试土壤放线菌  17
    1.1.3 筛选样品的制备  17-18
  1.2 结果与讨论  18-21
    1.2.1 结果  18-19
    1.2.2 讨论  19-21
第二部分 3423#放线菌抗肿瘤活性成分的研究  21-39
  第一章 3423#放线菌的发酵培养  21-25
    1.1 仪器与材料  21
    1.2 实验方法  21-22
      1.2.1 优选单克隆菌株  21-22
      1.2.2 扩大发酵  22
      1.2.3 干重法测定细菌的生长情况  22
      1.2.4 发酵时间的确定  22
      1.2.5 发酵产物体外活性测定  22
    1.3 结果与讨论  22-25
      1.3.1 发酵生长曲线  22-23
      1.3.2 对K562细胞的抑制活性  23-24
      1.3.3 讨论  24-25
  第二章 3423#放线菌代谢物的分离纯化  25-30
    2.1 仪器与材料  25
    2.2 实验方法  25-29
      2.2.1 代谢产物的提取  25-26
      2.2.2 代谢产物的分离纯化  26-29
    2.3 结果  29-30
  第三章 化合物的结构鉴定  30-39
    3.1 仪器与材料  30
    3.2 化合物结构鉴定  30-37
    3.3 讨论  37-39
第三部分 2215#放线菌抗肿瘤活性成分的研究  39-50
  1.1 发酵  39-40
    1.1.1 培养基组成  39
    1.1.2 实验方法  39
    1.1.3 实验结果  39-40
  1.2 提取分离  40-41
  1.3 结构鉴定  41-48
  1.4 结果和讨论  48-50
第四部分 化合物体外活性及机制研究  50-58
  1 细胞活性测定  50-53
    1.1 材料和方法  50-51
      1.1.1 仪器与试剂  50
      1.1.2 实验细胞  50
      1.1.3 实验方法  50-51
    1.2 实验结果  51-53
  2 化合物对BCR-ABL蛋白表达的抑制作用  53-57
    2.1 仪器与材料  53-54
    2.2 实验方法  54-55
      2.2.1 细胞培养  54
      2.2.2 细胞裂解  54
      2.2.3 BCA法蛋白定量  54
      2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  54
      2.2.5 染色,脱色  54
      2.2.6 Western-blot检测BCR-ABL蛋白的表达  54-55
    2.3 实验结果  55-57
  3 讨论  57-58
第五部分 结论  58-61
参考文献  61-65
附录一  65-87
附录二  87-95
致谢  95

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学
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