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HBV和HIV假病毒载体系统的初步研究

作　者: 安小平
导　师: 姜永强；童贻刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 肝特异性病毒载体乙肝病毒 HIV 基因转运
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

治疗乙肝、艾滋病仍然是棘手的问题，本研究试图将乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）和人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）改造为基因治疗载体，主要进行了以下研究工作：乙肝感染性克隆的构建我们利用酶切的方法将含有乙肝病毒adw2亚型全长HBV DNA的质粒分别克隆到载体pUC19和pCDNA3.1上，分别获得pUV-HBVxm（含有1.6倍乙肝病毒基因组）和pCDNA-HBVxm（含有1.4倍乙肝病毒基因组）。这两种质粒可以在HBV启动子引导下合成全长的genomic RNA，理论上可以生成病毒颗粒。用脂质体Lipofectamine^TM2000将上述两种感染性克隆分别转染人肝癌细胞系HepG2细胞，用ELISA方法检测到细胞培养上清有抗原表达。上述研究为本课题下一步的研究设立阳性对照。HBV假病毒包装系统的建立以质粒pUV-HBVxm为基础通过分步酶切的方法，仅删除包装信号区基因序列，保留X、C、P、S编码基因，从而获得可以表达HBV全部蛋白但不能包装的辅助质粒HelperHBV。构建的辅助载体HelperHBV转染人肝癌细胞系HepG2细胞，通过G418加压筛选，ELISA方法检测培养液上清HBsAg和HBeAg，筛选到稳定高表达HBsAg和HBeAg的细胞克隆2株。HBV假病毒载体的构建利用基于PCR技术的定点突变引入移码突变或无义突变，分别破坏X、C、P区开放读码框，并且以egfp替代S区基因构建了载体PseudoHBV。该载体含有1.4倍乙肝病毒基因组，其中包括包装信号序列和一些HBV顺式作用元件如启动子和多腺苷酸化位点，因此在特定条件下它能包装和复制并且产生全长3.2kb的假病毒，该假病毒包含报告基因egfp和突变的乙肝病毒基因组。假病毒载体PseudoHBV转染上述包装细胞系后，24h可以观察到绿色荧光蛋白的表达。该载体和辅助载体HelperHBV共转染HepG2细胞，用G418加压筛选同样获得既能稳定表达HBsAg和HBeAg又能表达绿色荧光蛋白的细胞株12株。HBV假病毒检测及分析通过电镜观察病毒颗粒、定量PCR（quantitative PCR）等一系列检测方法对假病毒进行了定性、定量分析。电镜观察稳定表达细胞克隆的培养上清有直径约42nm的病毒颗粒存在，为了进一步分析假病毒的产生效率，我们建立了实时PCR（Real-time PCR）方法检测假病毒和含量，细胞系培养上清中假病毒量约为10³拷贝/μ1，辅助细胞系培养上清中未检测到病毒。HIV-1假型病毒载体的构建将“假病毒治疗真病毒”的思路应用于治疗艾滋病（Acquired immune deficieney syndrome，AIDS）的研究，通过改造HIV标准株质粒NL4-3，用绿色荧光蛋白基因egfp替代部分env基因（保留和其重叠的vpu及rre），得到EGFP重组慢病毒载体NL4-3-EGFP。用水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）包装该重组病毒基因组，可形成假型病毒。将NL4-3-EGFP和VSV-G共转染人胚肾细胞系HEK 293FT细胞，24h可以观察到绿色荧光蛋白的表达，收集转染72h的培养上清，该上清可以进一步的感染HEK 293FT细胞。感染过程中加入不同浓度抗HIV药物的叠氮胸苷AZT，结果发现：不同浓度的AZT能不同程度的抑制报告基因即绿色荧光蛋白表达，验证了AZT的抗病毒作用，表明该细胞模型可以作为一个安全有效的抗-HIV药物筛选模型。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-13
  (一) 研究目的和意义  9
  (二) HBV和HIV感染的基因治疗  9-10
  (三) “假病毒治疗真病毒”的策略  10-11
  (四) 本课题研究内容  11-13
第一部分乙肝感染性克隆的构建  13-20
  1 材料与方法  13-16
  2 结果  16-19
  3 讨论  19-20
第二部分 HBV假病毒包装系统的建立  20-26
  1 材料和方法  20-21
  2 结果  21-25
  3 讨论  25-26
第三部分 HBV假病毒载体的构建  26-36
  1 材料和方法  26-28
  2 结果  28-34
  3 讨论  34-36
第四部分 HBV假病毒检测及分析  36-43
  1 材料与方法  36-37
  2 结果  37-39
  3 讨论  39-43
第五部分 HIV假型病毒载体的构建  43-52
  1 材料与方法  43-44
  2 结果  44-49
  3 讨论  49-52
总结  52-53
参考文献  53-57
附录主要试剂、溶液、仪器及分析软件  57-60
综述 HBV的动物模型  60-68
论著肝特异性假病毒转运系统的构建  68-77
主要简略语表  77-79
个人简历  79-80
致谢  80

HBV和HIV假病毒载体系统的初步研究

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