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超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii两种DEXD-box DNA解旋酶的生物化学性质鉴定

作　者: 李卓
导　师: 倪金凤；申玉龙
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 超嗜热古菌 DEXD框解旋酶复制叉回退
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

环境中的很多因素以及生物体内的一些代谢产物都能造成DNA损伤，生物体内也有相应的机制来修复DNA的损伤，以维持基因组的稳定和生理活动的正常进行。超嗜热古菌生活在较高的温度下，其DNA损伤的发生机率相对于生活在常温的生物来说要高得多，然而至今为止，并没有证据显示嗜热古菌的DNA变异率比常温生物高。这说明嗜热菌体内应该相应地存在着高效的DNA损伤修复机制，古菌中参与DNA代谢的主要蛋白和真核生物的相近，但成分相对简单。因此，通过研究古菌中的DNA修复相关的蛋白，可以为真核生物修复途径的研究提供可借鉴的理论模型。同时，对DNA修复相关蛋白的研究也有助于为解开许多人类疾病的发病机理提供理论支持。DEXD框是解旋酶中一个普遍存在的保守区域，该区域中由于含有一个Asp-Glu-Ala(X)-Asp核心而得名，此核心被认为是ATP的结合位点，为解旋酶的解链提供能量。含有DEXD框的解旋酶已被证实参与DNA解链以及前RNA剪切成熟等一系列核酸代谢过程。如大肠杆菌的RecQ和RecG即是含有DEXD保守框的解旋酶。其中RecQ已被证明对维持基因组的稳定起着重要的作用，真核生物中含有RecQ的同源蛋白，而古菌中并没有发现其氨基酸序列同源物。近期有报道显示古菌中的广古菌中存在与RecQ功能上同源的蛋白。RecG普遍认为是参与复制叉重启动的关键蛋白，但无论是在真核生物还是在古菌中，都没有其序列同源蛋白的存在。鉴于古菌RecQ功能同源蛋白的报道，我们推测古菌中也可能具有功能和性质上类似于RecG的蛋白。在本项研究中我们对超嗜热古菌Solfolobus Tokodaii Str.7基因组中两个含有DEXD box的可能的解旋酶ST0147和ST0590的基因进行克隆，对其蛋白进行表达和纯化。通过活性的初步检测，发现这两个蛋白具有依赖于ATP的解旋酶活性。在进一步对其活性的检测中我们发现它们的解链活性能被PCNA亚基所激活。虽然各种PCNA亚基对这两个解旋酶的激活情况不同，但被激活的性质为该酶参与复制提供了线索。随后我们设计了复制叉结构的DNA底物来检测ST0147和ST0590的解链活性。结果显示这两个酶都对复制叉新生链具有较强的解链活性。然而它们对两条新生链的解链性质有所不同。ST0147具有微弱的解链极性，而ST0590不具备解链极性，显示了这两个解旋酶的差异。我们在检测解链活性时，发现双链DNA底物总是不能完全被降解，这使我们检测了这两个酶的退火活性。有意思的是这两个解旋酶都能促使互补的DNA单链退火。然而它们促使互补链退火的效率因DNA形状的不同而存在差异。ST0590倾向于将两个含有新生链的模板链退火产生复制叉形状，ST0147则具有较广泛的退火活性。这种倾向于解开新生链而能促使模板链退火的功能非常类似于大肠杆菌RecG蛋白的性质，于是我们就按照RecG的检测条件设计了DNA底物结构，果然观察到了其中一个解旋酶ST0147具有使复制叉回退成Holliday中间体的能力；另一个解旋酶ST0590的链退回活性并没有观察到。ST0147的这种性质跟已报道的大肠杆菌RecG的体外活性检测性质相同。因此我们推断此蛋白可能是古菌中行使大肠菌RecG蛋白功能的功能类似物。为了进一步证实这一推断，还有待进一步实验的证实。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章前言  11-33
  1.1 生物界分类、超嗜热古菌及SULFOLOBUS TOKODAII STR.7简介  11-13
    1.1.1 生物分类及超嗜热古菌概述  11-12
    1.1.2 Sulfolobus tokodaii Str.7  12-13
  1.2 古菌的基因组特征及超嗜热古菌对研究DNA代谢的意义  13-14
    1.2.1 古菌的基因组特征  13-14
    1.2.2 超嗜热菌对研究DNA代谢的意义  14
  1.3 超嗜热古菌中的DNA复制、重组和修复相关蛋白的研究现状  14-23
    1.3.1 DNA复制相关蛋白  14-18
    1.3.2 古菌中DNA重组相关蛋白的研究  18-19
    1.3.3 古菌中的DNA修复  19-20
    1.3.4 DNA修复及其与复制重组的关系以及重组修复的概念  20
    1.3.5 细胞中的复制叉停滞、修复与复制叉再启动  20-23
  1.4 各种解旋酶及其在生物体内的功能  23-32
    1.4.1 什么是解旋酶  23
    1.4.2 解旋酶的分类  23-24
    1.4.3 DEXD box DNA解旋酶  24-25
    1.4.4 解旋酶的作用机制  25-28
    1.4.5 目前已广泛研究的解旋酶  28-32
  1.5 本试验的立题依据和基本思路  32-33
    1.5.1 立题依据  32
    1.5.2 基本思路  32-33
第二章 DNA解旋酶ST0590、ST0147和PCNA三个亚基基因的克隆和蛋白的表达纯化  33-41
  引言  33
  2.1 实验材料和试剂  33
    2.1.1 实验材料  33
    2.1.2 试剂及仪器  33
  2.2 实验方法和操作步骤  33-38
    2.2.1 目的基因的克隆  33-37
    2.2.2 蛋白表达及纯化  37-38
  2.3 结果  38-40
    2.3.1 基因克隆  38-40
    2.3.2 蛋白表达纯化  40
  小结  40-41
第三章 DNA解旋酶ST0147的性质研究  41-65
  引言  41-42
  3.1 实验材料和试剂  42
  3.2 实验方法和操作步骤  42-47
    3.2.1 DNA底物制备  42-44
    3.2.2 DNA结合实验的检测原理及过程  44
    3.2.3 ATPase活性检测原理及过程  44-45
    3.2.4 解旋酶活性检测原理及过程  45-46
    3.2.5 退火活性和复制叉退回活性检测原理及过程  46-47
  3.3 结果与讨论  47-63
    3.3.1 DNA结合试验和ATPase活性检测  47-51
    3.3.2 解旋酶活性依赖于ATP  51
    3.3.3 ST0147的解链活性可以不同程度的被PCNA亚基激活  51-54
    3.3.4 ST0147对复制叉母链和新生链解链活性的比较  54-57
    3.3.5 ST0147解链极性检测  57-59
    3.3.6 退火活性检测  59-61
    3.3.7 复制叉退回活性检测  61-63
  3.4 小结  63-65
第四章 DNA解旋酶ST0590的性质研究  65-75
  引言  65
  4.1 材料方法及实验原理  65
  4.2 结果与讨论  65-74
    4.2.1 ST0590 ATPase活性检测  65-66
    4.2.2 ST0590的解旋酶活性依赖于ATP  66
    4.2.3 ST0590的解链活性可以被Mg~(2+)激活  66-67
    4.2.4 ST0590的解链活性可以不同程度的被PCNA亚基激活  67-69
    4.2.5 ST0590对复制叉母链和新生链解链活性的比较  69-70
    4.2.6 ST0590在复制叉处对两条新生链的解链强度一致  70-71
    4.2.7 极性测定显示ST0590没有明显的解链极性  71
    4.2.8 退火活性检测  71-74
  4.3 小结  74-75
第五章总结与展望  75-77
  5.1 总结  75-76
  5.2 展望  76-77
参考文献  77-91
附1:本文所使用的仪器及试剂  91-92
附2:本文所涉及的基因序列代码  92-93
附3:本文所涉及的蛋白序列代码  93-94
附4:本文所涉及的培养基  94-95
附5:用于PCR扩增的引物序列  95-96
附6:PCR扩增及双酶切的体系  96-98
附7:标记寡核苷酸体系  98-100
致谢  100-101
攻读学位期间发表的学术论文  101-102
学位论文评阅及答辩情况表  102

超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii两种DEXD-box DNA解旋酶的生物化学性质鉴定

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