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2型猪链球菌srtBCD基因簇菌毛样结构蛋白SSU2101生物学功能研究

作　者: 秦跃红
导　师: 唐家琪
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 2型猪链球菌 srtBCD基因簇菌毛样结构蛋白生物学功能
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,简称S. suis 2)是一种重要的人兽共患病病原体,不仅可致猪患急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡,而且可通过伤口等传播途径,导致人的感染发病和死亡,对养猪业及相关从业人员均造成严重威胁。特别值得关注的是,1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模的S. suis 2感染疫情,患者出现链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome, STSS),病情凶险,病死率高。因此,加强对S. suis 2感染的预防和控制成为一个亟待解决的问题,由于目前对S. suis 2的致病机制尚不明确,再加上近年来多重耐药菌株的出现,对S. suis 2的预防和控制尚没有有效的药物和治疗措施,因此加快对其致病机理及疫苗候选分子的研究显得极为迫切。近几年对A群链球菌、B群链球菌和肺炎链球菌的研究发现,菌毛在细菌的黏附、侵袭和致病过程中起到关键作用,并且菌毛结构蛋白能够在其动物模型中产生免疫保护作用,可作为疫苗的候选靶标。通过对本实验室保存的S. suis 2中国强毒株05ZYH33全基因组注释分析,本课题组发现两个在结构特征上与已知革兰阳性病原菌菌毛编码基因完全一致的基因簇,分别编码一组sortase转肽酶和与已知菌毛结构蛋白同源的膜蛋白,命名为srtBCD和srtF菌毛基因簇,其中srtBCD菌毛基因簇仅存在于强毒株中。鉴于此,我们选取srtBCD菌毛基因簇编码的主要结构蛋白(backbone protein, BP)SSU2101进行原核表达和纯化,证实该蛋白在S. suis 2感染宿主过程中表达,能引发宿主的特异性免疫反应,在小鼠模型中发挥免疫保护作用,显著提高小鼠感染S. suis 2后的存活率,可以作为疫苗的候选分子。利用同源重组基因敲除方法构建△BP敲除突变株,PCR分析、Southern杂交、RT-PCR及流式细胞术均证实成功构建了BP基因缺失突变株;生物学特性分析显示,突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株均无明显差异;黏附试验结果显示,BP在05ZYH33对Hep-2细胞的黏附过程中不是必需的;小鼠致病性试验结果显示,突变株的毒力比野生株显著减弱。以上研究结果提示菌毛样结构蛋白在S. suis 2感染致病过程中起着重要作用,为系统研究S. suis 2菌毛分子装配机制及其生物学功能奠定基础。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-17
第一章 2 型猪链球菌菌毛主要结构蛋白的生物信息学及共转录分析  17-25
  1 实验方法  17-20
    1.1 菌毛主要结构蛋白编码基因的筛选及序列分析  17
    1.2 srtBCD 菌毛基因簇共转录分析  17-20
  2 结果  20-22
    2.1 srtBCD 菌毛基因簇BP 的生物信息学分析  20-21
    2.2 反转录PCR 分析srtBCD 菌毛基因簇共转录情况  21-22
  3 讨论  22-25
第二章菌毛样结构蛋白BP 原核表达及其免疫保护作用  25-37
  1 材料和试剂  25-26
    1.1 质粒和菌株  25
    1.2 试剂  25-26
  2 实验方法  26-30
    2.1 BP 信号肽、跨膜序列的预测  26
    2.2 S. suis 2 05ZYH33 基因组DNA 的提取  26
    2.3 PCR 扩增BP 编码基因  26
    2.4 重组质粒pMD18-T::BP 的构建  26-27
    2.5 重组表达载体pET32a::BP 的构建和鉴定  27-28
    2.6 重组蛋白的表达和纯化  28-29
    2.7 免疫印迹分析BP 的免疫原性  29
    2.8 兔抗BP 多克隆抗体的制备  29
    2.9 抗BP 血清对全血杀菌的促进作用  29-30
    2.10 动物免疫保护试验  30
    2.11 统计学分析  30
  3 结果  30-35
    3.1 BP 信号肽、跨膜序列预测结果  30-31
    3.2 目的片段的克隆  31
    3.3 重组表达质粒的鉴定  31
    3.4 目的蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化  31-32
    3.5 免疫印迹分析BP 的免疫原性  32-33
    3.6 Western blot 鉴定兔抗血清的特异性  33
    3.7 间接ELISA 测定血清抗体滴度  33-34
    3.8 抗BP 血清促进全血对S.suis 2 的杀伤作用  34
    3.9 动物免疫保护试验  34-35
  4 讨论  35-37
第三章菌毛主要结构蛋白编码基因SSU2101 敲除突变株的构建  37-50
  1 材料和试剂  37-38
    1.1 菌株﹑质粒及引物  37-38
    1.2 主要试剂和仪器  38
  2 实验方法  38-45
    2.1 构建重组敲除质粒pUC18::BP  38-39
    2.2 制备05ZYH33 感受态细菌  39-40
    2.3 重组质粒电转化感受态细胞  40
    2.4 基因敲除突变株△BP 的筛选和PCR 初步鉴定  40
    2.5 突变株?BP 的Southern 杂交分析  40-44
    2.6 RT-PCR 鉴定  44-45
    2.7 流式细胞术检测  45
    2.8 统计学分析  45
  3 实验结果  45-48
    3.1 重组敲除质粒pUC18::BP 的鉴定  45-46
    3.2 突变株△BP 的初步筛选  46-47
    3.3 突变株?BP 的Southern 杂交及RT-PCR 鉴定  47-48
    3.4 流式细胞术检测  48
  4 讨论  48-50
第四章突变株△BP 的生物学功能研究  50-61
  1 材料和试剂  50-51
  2 实验方法  51-53
    2.1 敲除突变株壮观霉素抗性表型的稳定性观察  51
    2.2 生长速率的比较  51
    2.3 菌落形态和溶血活性的比较  51
    2.4 革兰染色和显微形态结构的比较  51-52
    2.5 黏附试验  52-53
    2.6 被感染动物发病情况及存活时间的比较  53
    2.7 竞争感染试验  53
    2.8 统计学分析  53
  3 实验结果  53-58
    3.1 敲除突变株壮观霉素抗性表型的稳定性观察  53-54
    3.2 生长曲线的比较  54
    3.3 菌落形态和溶血活性的比较  54-55
    3.4 革兰染色和显微形态结构的比较  55
    3.5 黏附试验  55-56
    3.6 小鼠致病性试验  56-58
    3.7 竞争感染试验  58
  4 讨论  58-61
全文总结  61-62
参考文献  62-68
综述革兰阳性菌菌毛的研究进展  68-79
  参考文献  74-79
攻读学位期间发表的论文  79-80
致谢  80

2型猪链球菌srtBCD基因簇菌毛样结构蛋白SSU2101生物学功能研究

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