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低氧对人肝癌细胞内ARE介导的NQO1酶基因表达及其对生物还原剂药物毒性的影响

作　者: 夏小俊
导　师: 金中初；郭峻
学　校: 浙江大学
专　业: 生理学
关键词: NNAD(P）H:醌氧化还原酶1 抗氧化反应元件低氧生物还原剂单细胞凝胶电泳／彗星实验
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

[目的] 研究低氧对肝癌细胞SMMC—7721生长和NQO1酶活性的影响，探明低氧是否和抗氧化剂都能够通过抗氧化反应元件（ARE）这一共同通路来介导NQO1基因表达，并对低氧下生物还原剂类药物对细胞毒性的改变及其对DNA损伤机制进行初步探讨。 [方法] 肝癌细胞SMMC－7721接种24h后，经低氧（pO₂≌O₂Vol％＜0.1％）处理不同时间段（6h，9h，12h，24h）后，分别用MTT法，微孔板直接测定法来检测细胞生长情况和NQO1酶活性。酶活性结果用NQO1酶比活性（specific activity）=A（NQO1酶活性）/B（细胞数）表示。同时提取细胞核蛋白，同电泳迁移实验（EMSA）来检测细胞核蛋白与抗氧化反应元件（ARE）的特异性结合。生物还原剂类药物AZQ／DZQ处理也在低氧下进行。用MTT法来反映药物的细胞毒性，同时用单细胞；疑胶电泳实验（彗星实验）来检测细胞的DNA损伤。DNA链断裂用碱性单细胞凝胶电泳（ASCGE）来检测，而DNA链交联用改良单细胞凝胶电泳（MSCGE）检测。 [结果] 1．低氧对肝癌细胞SMMC-7721生长和ARE介导的NQO1酶基因表达调控的影响低氧对肝癌细胞生长和NQO1酶活性的影响呈现时相性变浙江大学颀士学位论文化。低氧处理 6h后细胞生长加快，而 NQOI酶活性较常氧组细胞降低；而超过这一时段后（gb，12h，24h）的细胞生长减缓，＊OI酶后性则比常氧组细胞要高。每个时间点低氧处理组与常氧组比较差异均有显著性汐＜oW＼低氧和常氧下细胞内始终有核蛋白与ARE探针特异性结合，而不能结合突变的ARE（mARE）探针；过量 NF八 B探针 XI 00倍)可以竞争结合常氧细胞核蛋白，而不能竞争结合低氧处理后的细胞核蛋白；相同浓度的AP 探针不能竞争结合细胞核蛋白。 2．低氧下生物还原剂（AZQ／DZQ）对 SMMC－772细胞的毒性改变及其机制。 AZQ与 DZQ在低氧下与常氧比较均呈现毒性升高，DZQ对低氧细胞更具选择毒性。在 ASCGE试验中，常氧下 AZQ厂 M，300 v M，600 v M)处理的细胞的N的拖尾率和尾长与对照组相比均有升高，而低氧下相同浓度处理的结果和对照组比较则无显著差异（P＞OOS），而与相应常氧组相比均有显著差异沪＜ooj)。常氧和低氧下以 DZQ（05vM，1刀 vM，15HM，50 vM）处理的细胞（汕）的拖尾率和尾长与对照组比较均无显著差异（尸＞0“）。而在 MSCGE试验中，用上述相应浓度的 AZQ在常氧下处理的细泡的拖尾军和尾长与对照组相比无显著差异，而在低氧下处理的细胞的尾长与对照组相比则有明显降低o＜0 0＊，与相应常氧组比较也有显著降低(P＜OW＼以上述相应剂量的DZQ在低氧和常氧下处理的细胞的尾长均有减轻，并且0．spM，1．opM，L5pM 剂量在低氧下处理的细胞尾长的减轻较常氧组更加明显（＜0．oj）。 l结论］浙江大学颀士学位论文 1．低氧能够抑制肝癌细胞主长和诱导细胞 NQO酶活性上升，并且均呈现时相性变化。在低氧诱导 NQOI酶活性上升时有转录因子与 ARE结合活性的改变，证明 ARE参与低氧诱导的 NQOI 酶活性的上调，而Aug 的特异性序列对于这些转录因子的结合是必须的。〕生物还原剂类药物AZQ＊ZQ在低氧下对细胞的毒性均有上升，而 DZQ更加明显。DZQ主要通过产生 DNA链交联来损伤细胞，而 AZQ在常氧下主要产生 DNA链断裂，在低氧下损伤类型则以涟交联为主。

全文目录

一、中文摘要  4-6
二、英文摘要  6-9
三、正文  9-43
  a）前言  9-11
  b）实验材料  11-16
  c）实验方法  16-22
  d）实验结果  22-35
  e）讨论  35-39
  f）参考文献  39-43
四、综述  43-55
五、致谢  55

低氧对人肝癌细胞内ARE介导的NQO1酶基因表达及其对生物还原剂药物毒性的影响

内容摘要

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