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新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒VP0基因在重组鸡痘病毒中的共同表达及其免疫原性

作　者: 许凌峰
导　师: 王兴龙
学　校: 中国人民解放军军需大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒F基因传染性法氏囊病毒VPO基因鸡痘病毒表达免疫原性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

本研究利用分子生物学技术将新城疫病毒(NDV)F基因和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VPO基因通过鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)内进行表达，并对其表达蛋白的免疫原性进行了检测。F蛋白和VPO蛋白是这两种疾病的主要保护性抗原，这两种蛋白的表达和免疫原性研究将为新城疫和传染性法氏囊病多价重组鸡痘病毒疫苗的研制奠定重要的基础。本研究的主要内容包括： 1．利用载体质粒pUTA-2，对之进行改建，在其上游插入一个与之结构相同，方向相反的复合启动子p7.5-ATI，并在两个启动子下游分别插入新城疫病毒F基因和传染性法氏囊VPO使基因方向与启动子方向一致，所得质粒经酶切鉴定显示插入的基因和启动子处于正确的位置和相同的转录方向。由两个相同的启动子在相反方向分别启动F和VPO基因转录。构建出重组质粒pATI2-F-VPO。该载体质粒含鸡痘病毒TK非必需区基因为侧翼，插入VV突变型p7.5串联启动子和由痘病毒A型包涵体晚期启动子(ATI)组成的复合启动子。本实验所选用的插入位点位于鸡痘病毒中胸腺激酶基因(TK)，是一种非必需基因，以其为插入位点，不影响鸡痘病毒正常生长，而且有利于进一步通过BrdU进行筛选重组病毒。从而避免通过报告基因进行筛选导致的种种弊端。 2．将重组质粒pATI2-F-VPO与鸡痘病毒282E4株同时转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，由于二者都含有TK基因序列，可以进行同源重组，利用BrdU加压筛选重组病毒(TK~-)并连续传代进行纯化。将筛选纯化的重组病毒进行间接免疫荧光(IFA)检测，在荧光显微镜下可观察到荧光反应。用NDV多抗和传染性法氏囊病单抗进行Western blot检测，在显色后可观察到特异的显色条带，证明重组质粒与病毒发生了同源重组，外源蛋白基因序列已插入到鸡痘病毒基因组内。得到了两株可同时表达F蛋白和VPO蛋白的重组病毒株。重组病毒正确表达了外源蛋白F和VPO，并对蛋白进行了正确的修饰加工。 3．无菌采取鸡脾脏，制备淋巴细胞悬液，用有丝分裂原ConA和PHA 刺激，通过放射性检测实验进行检测，可发现免疫组的淋巴细胞转化率明显高于对照组。该重组病毒能明显刺激淋巴细胞增殖，说明重组病毒所表达蛋白能有效地刺激机体产生免疫反应。

新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒VP0基因在重组鸡痘病毒中的共同表达及其免疫原性

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