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微流控动物细胞培养芯片的研究

作　者: 张宝月
导　师: 孙宝国；何聪芬；王战会
学　校: 北京工商大学
专　业: 生物化工
关键词: 微流控软光刻技术细胞培养荧光免疫实验
分类号: TN492
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前,国内外细胞生物学实验室还普遍采用传统的细胞研究手段,使用传统的细胞培养瓶、培养板等培养细胞,几乎所有的细胞研究过程都是通过手工完成,在操作过程中如收集细胞、更换培养基和细胞传代处理往往较繁琐、耗时及耗试剂量大。一种在每个小室里带有八个微筛的微流控细胞芯片培养平台显示了其可连续培养的能力。在这八个微筛的辅助下,细胞可以均匀地分布。在这些阵列中,细胞增殖到融合状态时可消化并重新获得。待细胞消化后在微筛内又重新被捕获从而在芯片中进行次代培养,建立一个若干周期连续传代培养的平台。这个微流控阵列细胞培养平台已通过BALB/3T3细胞系、人脐带血间充质干细胞、HeLa细胞、牛内皮细胞、乳腺癌细胞(MCF-7)得到了证明。目前此微流控细胞芯片培养平台展示了集成温度控制、微流体控制、微泵等形成一完全自动化细胞培养系统的潜力。在生命科学里,细胞培养是一个基本且强有力的技术。一个世纪以来,细胞培养在人们解释许多生物现象上做出了很大的贡献,比如包内酶活性、细胞内代谢通量、细胞与细胞之间的相互作用等等。在近几年,高密度的细胞培养阵列,包括微流控阵列,由于其具有实现快速大规模细胞实验的潜力,引起了许多人的兴趣。许多微流控细胞阵列已经被用于研究包内酶活性、化学浓度梯度对细胞的刺激、细胞分化、基因表达的动力学特征和高通量药物筛选,且都在纳升或皮升级下进行。在大批细胞培养方式下,细胞播种密度的差异、营养输送和代谢废物清除是影响生物学检测准确度的一个重要因素。由于此研究强调改变大批培养方式,在微培养单元中的细胞行为,单细胞水平的研究,细胞存活率和标准化、均一化生长条件显得很重要。许多微流控芯片设计力图到达高通量,但未能使细胞在整个芯片阵列中均匀分布。在本研究中,阐述了微流控细胞连续传代培养平台,集成了在微培养室内带U-型筛的阵列,细胞均匀分布及生长,而其稳定从微室中控制培养液输送和排除的能力促进细胞存活。主要实验结果如下:1.采用SU-8-10负胶做PDMS芯片模板较佳,其优化工艺是:旋涂SU-8-10负胶前等离子处理10秒钟,旋涂速度为750RPM(20μm);前烘:先60℃下5分钟,后90℃下8分钟;中烘:先60℃下1分钟,后90℃下3分钟;曝光18s,光强:40mW/cm2;显影3分钟;90℃下烘干。2. U-型筛有效促进细胞均匀分布:平均密度为10/筛,100/微室。3.微流控细胞芯片微单元间的细胞数目偏差控制在了10%以内。4.此细胞芯片成功培养各种动物细胞如:人脐带血间充质干细胞、HeLa细胞、牛内皮细胞、MCF-7乳腺癌细胞等,形态和在传统培养皿里相似。5.在此细胞芯片里能实现细胞反复传代培养细胞,且与传统的细胞培养瓶(细胞存活率95%)相比,在微流控细胞芯片中能够获得更高的细胞存活率,达到98%以上。6.流式细胞术分析和微流控细胞芯片荧光免疫分析结果一致,都显示了脐带血干细胞强表达表面标记物CD44、CD73和CD105,而CD34、HLA-DR和CD45表达为阴性。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章绪论  11-29
  1.1 微流控芯片技术简介  11
  1.2 微流控芯片技术研究进展  11-18
    1.2.1 微流控芯片技术发展历程  11-12
    1.2.2 微流控芯片材料与制作  12-18
  1.3 基于细胞的微流控芯片研究现状  18-27
    1.3.1 细胞培养  18-19
    1.3.2 微流控芯片细胞培养  19-20
    1.3.3 细胞芯片材料  20-22
    1.3.4 细胞芯片微结构设计  22-23
    1.3.5 微流控细胞芯片在细胞分析中的应用  23-27
  1.4 本课题研究背景及研究意义  27
  1.5 课题研究内容  27-29
第二章细胞芯片制作  29-42
  2.1 引言  29-30
  2.2 实验材料  30-31
    2.2.1 硅、玻璃与相关材料  30
    2.2.2 主要试剂  30
    2.2.3 主要仪器设备  30-31
  2.3 实验方法  31-34
    2.3.1 微流控细胞芯片设计  31-32
    2.3.2 微流场模拟  32
    2.3.3 微流控细胞培养芯片制作  32-34
  2.4 结果与讨论  34-41
    2.4.1 微流控细胞芯片设计与模拟  34-36
    2.4.2 PDMS 模具制作光刻胶及工艺筛选  36-40
    2.4.3 PDMS 成型与键合  40-41
  2.5 小结  41-42
第三章建立微流控芯片细胞传代培养模型  42-51
  3.1 引言  42
  3.2 实验材料  42-43
    3.2.1 细胞  42
    3.2.2 主要试剂  42-43
    3.2.3 主要溶液配制  43
    3.2.4 主要仪器设备  43
  3.3 实验方法  43-45
    3.3.1 微流控芯片细胞培养系统与宏微连接  43-44
    3.3.2 微流控芯片细胞连续培养模型的建立  44-45
    3.3.3 微流控细胞芯片预处理  45
    3.3.4 MTT 法绘制细胞生长曲线  45
  3.4 结果与讨论  45-50
    3.4.1 细胞芯片处理  45-46
    3.4.2 几种动物细胞在芯片中的连续培养.  46-47
    3.4.3 微流控芯片法与MTT 法绘制MSCs 生长曲线比较  47-49
    3.4.4 细胞计数定量分析及存活率检测  49-50
  3.5 小结  50-51
第四章微流控细胞芯片荧光免疫实验  51-59
  4.1 引言  51
  4.2 实验材料  51-53
    4.2.1 细胞  51
    4.2.2 主要试剂  51-52
    4.2.3 主要溶液配制  52
    4.2.4 主要仪器设备  52-53
  4.3 实验方法  53-54
    4.3.1 脐带血干细胞的冻存与复苏  53
    4.3.2 流式细胞免疫检测（FACS）  53-54
    4.3.3 微流控细胞芯片免疫检测步骤  54
  4.4 结果与讨论  54-58
    4.4.1 微流控细胞芯片荧光免疫分析  54-56
    4.4.2 流式细胞术分析  56-57
    4.4.3 几种荧光免疫检测结果对比  57-58
  4.5 小结  58-59
结论与展望  59-61
  结论  59
  展望  59-60
  本论文的创新之处  60-61
附录A 蠕动式微泵控制系统  61-64
参考文献  64-67
攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果  67-68
致谢  68

微流控动物细胞培养芯片的研究

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