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黄鳝Ostf和β-actin基因的克隆与表达分析及其BAC文库的初步构建

作　者: 夏来新
导　师: 程汉华；周荣家
学　校: 武汉大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 黄鳝 性别决定 Ostf β-actin 系统发生 BAC文库
分类号: Q953
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


很多机制参与了脊椎动物的性别发育这个复杂的过程。然而,参与性别决定和分化的基因目前很多都未知。黄鳝是具有天然的性反转的淡水鱼类,在它的一生中会经历先雌后雄的性别发育过程,其分子机理目前仍不清楚。我们从它的性腺中,克隆到人破骨细胞刺激因子Ostf(osteoclast-stimulating factor)的同源基因。聚类分析表明该基因和其它物种Ostf基因有很强的同源性。它编码一个含214个氨基酸的多肽,其中含有SH3 domain(c-Src homology 3 domain),ankyrin repeats和N端的脯氨酸富集区,这提示它可能参与了细胞内的信号传导。随后我们研究了它的表达特征,尽管该基因是广谱表达的,但是它在黄鳝性腺中的表达却只局限于生殖上皮。黄鳝的生殖上皮中含有双向分化潜能的生殖细胞,暗示着该基因可能参与了黄鳝的性反转。 β-actin是actin家族的一员,β-actin在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。我们克隆了黄鳝的β-actin基因。它的cDNA全长1860bp,编码375个氨基酸,在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过了98%。基于目前已知的全部鱼类的β-actin cds和3’UTR,我们分别构建了进化树。结果它们都一致支持将鱼类的β-actin基因划分为四类。黄鳝的β-actin基因属于其中的第二类。同时RT-PCR表明我们克隆的黄鳝的β-actin基因在睾丸、卵巢、心、肝、脾、脑等组织中广谱表达。 BAC(细菌人工染色体)文库在分析复杂的基因组结构、功能方面有着非常重要的作用。黄鳝基因组很小,只有600Mb,我们设法构建它的基因组BAC文库。基因组DNA用BamHI部分消化,然后通过脉冲场电泳两次选择回收,电洗脱,最后克隆到pBeloBAC11的衍生型载体plndigoBAC-5中。初步结果,得到了3000个克隆,平均插入片段110kb,空斑率12%。尽管最终高覆盖率的文库没有最终完成,但是这为以后构建基因组覆盖的BAC文库提供了相应的技术基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
前言  9-18
  一 性别决定和分化相关的基因  11-12
    (一) Sry和Sox9  11-12
    (二) Dmrt1和DMY  12
    (三) Fgf9和胰岛素受体基因insulin receptor gene  12
    (四) 其它性别决定基因  12
  二 鱼类的性别决定和分化  12-14
  三 Ostf基因  14-15
  四 β—actin基因  15
  五 BAC文库  15-16
  六 本研究的主要内容和目的  16-18
材料和方法  18-34
  一 材料与试剂  18-19
  二 实验方法  19-34
    (一) Ostf cDNA克隆的获得和相关的序列分析  19-20
    (二) Ostf基因在基因组中的southern杂交  20-23
    (三) Ostf基因表达模式的研究  23-29
    (四) 黄鳝β—actin基因的克隆及序列分析  29-31
    (五) 黄鳝基因组BAC文库的构建  31-34
结果和分析  34-47
  一 雄性黄鳝性腺SMARTcDNA文库插入片段的检测  34
  二 黄鳝Ostf基因序列分析  34-37
    (一) 测序  34-35
    (二) Ostf基因的同源序列比对  35-36
    (三) Ostf基因系统发生分析  36-37
  三 黄鳝Ostf基因的基因组southern杂交  37-38
  四 黄鳝Ostf基因的表达特征分析  38-39
    (一) 总RNA和mRNA的提取  38
    (二) cDNA合成及RT-PCR  38
    (三) Northern blot  38-39
    (四) 组织原位杂交  39
  五 黄鳝β—actin基因的克隆及序列分析  39-45
    (一) 基因克隆  39-42
    (二) 序列分析  42-45
  六 黄鳝BAC文库的构建  45-47
    (1) 部分消化酶切条件的确定  45
    (2) 两次脉冲场电泳选择回收  45-46
    (3) 回收的大片断DNA定量  46
    (4) 转化结果及酶切鉴定  46-47
讨论  47-51
  一 Ostf基因的表达及功能  47-48
  二 鱼类β-actin基因的系统发生  48-49
  三 黄鳝基因组BAC文库的初步构建  49-51
参考文献  51-60
研究生期间发表的论文  60-61
致谢  61

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