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柑橘毛状根的诱导及其与丛枝菌根真菌的双重培养

作　者: 赵长竹
导　师: 孙中海
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘毛状根丛枝菌根真菌双重培养发根农杆菌
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

柑橘可以和丛枝菌根真菌形成互惠共生体——丛枝菌根。丛枝菌根真菌可以帮助根毛稀少的柑橘获取水分和矿质营养,促进柑橘生长发育,增强柑橘抗逆境能力,而柑橘可以为丛枝菌根真菌提供所需的碳源。鉴于丛枝菌根对柑橘的重要性,开展柑橘丛枝菌根的相关研究势必会对柑橘产业的可持续发展产生深远影响。本研究尝试利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化的柑橘毛状根与丛枝菌根真菌建立双重培养系统,以期为柑橘丛枝菌根的离体研究建立一个初级平台。主要结果如下: 1.以发根农杆菌A4d菌株转化40d龄的枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)上胚轴,研究鱼鳞状划伤处理对毛状根诱导率的影响,其结果为:经过鱼鳞状划伤处理的上胚轴的转化率为66.7%,未经鱼鳞状划伤处理的上胚轴转化率为29.2%,差异显著。 2.以发根农杆菌A4t菌株转化经过鱼鳞状划伤处理的柠檬(Citrus limon(L.)Burm.)外植体,结果为:①生长15d和105d的柠檬的上胚轴转化率分别为70.8%和83.3%,差异不显著;②生长15d的柠檬的上胚轴和子叶的转化率分别为67.5%和23.3%,差异显著。结果表明柑橘外植体类型是影响转化率的重要因素之一,而苗龄次之;上胚轴适度老化可以提高转化率。 3.柠檬毛状根显示出形态变异性和形态多样性,通过单克隆筛选获得优良的柠檬毛状根克隆OL2-1、OLxx1、OL13-2、YL22-4和YL8-1。枳毛状根只有伸长能力,不具有分枝能力,没有获得优良克隆。 4.柠檬毛状根克隆OL2-1在同种培养基上2w和4w后的净生长量差异不显著,而在不同种培养基上2w或4w后的净生长量却有显著差异。毛状根在培养基Ⅳ生长量超过10.0mm,4w后绝大多数毛状根保持基本活力;毛状根在培养基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ上的生长量不足3.5mm,4w后几乎全部死亡。结果表明Tris·HCl缓冲液极有可能对克隆OL2-1有毒害作用,并使其致死;而培养基中营养元素不均衡是次要因素。 5.丛枝菌根真菌孢子在培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ上的萌发情况具有显著的种间差异性,而无显著的种内差异性。珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita Becker&Hall(NC121A)孢子和摩西球囊霉Glomus mosseae(Nocolson&Gerd.) Trappe&Gerd.(CA127)孢子的平均萌发率分别为38.0%和3.3%,低于前人的研究结果。这表明AMF孢子对培养基有较广泛的适应性,孢子活力系影响孢子萌发率的主要因素,孢子活力具有种属差异性。 6.在培养基Ⅳ上将珠状巨孢囊霉孢子和摩西球囊霉孢子分别接种到克隆OL2-1根尖处,尝试建立双重培养系统。珠状巨孢囊霉与克隆OL2-1成功建立双重培养,形成丛枝菌根,但是未产孢;摩西球囊霉与克隆OL2-1未实现双重培养。孢子种类、

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
缩写词表  9-10
前言  10-22
  1 问题的提出  10-11
  2 发根农杆菌介导遗传转化的研究进展  11-13
    2.1 发根农杆菌转化植物的研究现状  11-13
      2.1.1 发根农杆菌介导遗传转化的机理  11-12
      2.2.2 影响农杆菌介导遗传转化的因子  12-13
        2.2.2.1 菌株类型  12-13
        2.2.2.2 外植体的种类和生理状态  13
        2.2.2.3 操作程序的优化  13
    2.2 发根农杆菌转化植物的应用  13
  3 (丛枝)菌根的研究现状  13-20
    3.1 菌根的类型  13-14
    3.2 丛枝菌根研究进展  14-19
      3.2.1 丛枝菌根与植物营养  14-17
        3.2.1.1 丛枝菌根与植物磷素营养  14-15
        3.2.1.2 丛枝菌根与植物氮素营养  15-16
        3.2.1.3 丛枝菌根与植物碳素营养  16-17
      3.2.2 柑橘菌根研究概况  17-19
    3.3 双重培养研究概况及应用进展  19-20
  4 本研究的目的和内容  20-22
材料与方法  22-27
  1 柑橘毛状根的获得  22-24
    1.1 柑橘材料的准备  22
    1.2 供试菌株的活化  22
    1.3 发根农杆菌转化柑橘材料  22-23
    1.4 柑橘毛状根的诱导与发生  23-24
    1.5 柑橘毛状根优良克隆的筛选  24
  2 柠檬毛状根优良克隆在培养基中的生长表现  24
  3 培养基对AMF孢子萌发的影响  24-25
    3.1 AMF菌种的扩繁  24-25
    3.2 AMF孢子的分离  25
    3.3 AMF孢子的表面消毒  25
      3.3.1 消毒液配制  25
      3.3.2 消毒程序  25
    3.4 AMF孢子的萌发试验  25
  4 柠檬毛状根与AMF的双重培养  25-27
    4.1 柠檬毛状根OL2-1克隆的准备  25
    4.2 毛状根和AMF孢子的接种、培养及观察  25-26
    4.3 AM的制片观察  26-27
结果与分析  27-34
  1 柑橘毛状根的诱导与培养  27-30
    1.1 柑橘毛状根的发生过程与生长特性  27-28
    1.2 鱼鳞状划伤处理对积毛状根诱导率的影响  28
    1.3 柠檬外植体类型及苗龄对毛状根诱导率的影响  28-29
    1.4 柑橘毛状根优良克隆的筛选  29-30
  2 柠檬毛状根OL2-1克隆在不同培养基中的生长表现  30-31
  3 AMF孢子萌发试验  31-32
  4 柠檬毛状根OL2-1克隆与AMF孢子的双重培养  32-34
    4.1 双重培养建立过程的观察  32
    4.2 双重培养建立过程的相关问题比较  32-34
讨论  34-38
  1 影响发根农杆菌介导的柑橘转化的因素  34-35
  2 柑橘毛状根诱导过程及生长特性的观察  35-36
  3 孢子萌发试验与双重培养的建立  36-38
图版和图版说明  38-46
  图版1 柑橘毛状根的诱导过程  39-41
  图版2 柠檬毛状根的形态变异性和形态多样性  41
  图版3 柠檬毛状根的生长特点  41-42
  图版4 珠状巨孢囊霉与柠檬毛状根的双重培养过程  42-46
参考文献  46-54
致谢  54-55
附录  55-56
  附录1 AMF孢子分离程序  55
  附录2 AMF孢子消毒程序  55-56
  附录3 AM制片程序  56

柑橘毛状根的诱导及其与丛枝菌根真菌的双重培养

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