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MLO-Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离
作 者: 李丹
导 师: 姜华;刘文广
学 校: 辽宁师范大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 成骨细胞,骨细胞,抑制性消减杂交 (SSH)MLO-Y4 Cbfal Osx
分类号: R34
类 型: 硕士论文
年 份: 2004年
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内容摘要
骨骼的形成和发育是与许多因素相关的复杂过程,转录因子是影响骨生长非常重要的因素。目前已知与成骨细胞分化相关的转录因子有两个:Cbfa1(Core Binding Factor 1)和Osx(Osterix)。Cbfa1于1997年被证明是控制骨形成的关键因子,适量表达可以促进成骨细胞的早期分化;而过量表达会抑制成骨细胞的成熟。2002年Kazuhisa等用抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)的方法分离出转录因子Osx。Cbfa1和Osx基因分别作用于成骨细胞分化的不同时期:Cbfa1调控间充质细胞向前成骨细胞分化,Osx在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中起作用。 本论文直接目的是分离可被Cbfa1诱导的新基因,长远目标在于找到与骨骼细胞分化相关转录因子。本文以具有早期骨细胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)细胞为研究对象,将Cbfa1基因转染到细胞内后,用抑制性消减杂交(SSH)方法进行新基因分离,成功构建了Cbfa1诱导下表达基因片段文库。从文库中随机选出的83个阳性克隆中,含有Cbfa1基因片段克隆24个,含有其它已知基因片段克隆19个,含有未知基因片段克隆40个,占克隆总数的67.8%。实验用Virtual Northern blot方法证明了其中一个没有同源序列的未知基因是Cbfa1诱导下表达的新基因。因为,在Cbfa1诱导的已知基因中有Osx存在,所以,MLO一Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离实验进一步以RT一PCR法证实在MLO一Y4细胞中Cbfal可以诱导osx表达。本实验同时用RT一PCR法在另两种成骨细胞MC3T3一El、UZOS中也检测到了Cbfal诱导osx的表达。
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全文目录
中文摘要 4-6 前言 6-19 一 文献综述 6-17 (一) 骨骼的发育及其影响因素 6-7 (二) 成骨细胞分化相关转录因子的研究及进展 7-12 1 Cbfa1的发现以及研究进展 8-10 2 Osx的发现以及研究进展 10-12 (三) MLO-Y4细胞简介 12 (四) 分离特异表达基因的方法研究以及进展 12-17 二 本论文的研究目的和意义 17-19 材料和方法 19-35 一 实验材料 19-20 1 细胞及其培养试剂 19 2 细胞转染以及RNA制备试剂 19 3 SSH相关试剂以及药品 19 4 主要仪器及设备 19-20 二 实验方法 20-35 1 MLO-Y4细胞的培养 20-21 2 大肠杆菌感受态细胞的制备 21 3 感受态细菌的转化及α互补筛选 21 4 转染质粒的制备 21-23 5 MLO-Y4细胞的转染 23-24 6 RNA的制备及电泳检测 24-25 7 RT-PCR 25-26 8 PCR-Selected subtraction(抑制性消减杂交SSH) 26-31 9 Virtual Northern blot 31-35 结果与分析 35-46 一 检测转染效率的RT-PCR结果 35 二 抑制性消减杂交(SSH)的结果 35-46 1 PCR法合成dsDNA 35-36 2 回收产物经过RsaⅠ酶切后电泳结果 36-37 3 两次PCR的结果 37 4 检测探针制备及Virtual Northern blot结果 37-38 5 构建消减文库以及测序结果 38-43 6 进一步筛选的结果 43-44 7 在MLO-Y4和另两种成骨细胞中Cbfa1对Osx作用 44-46 讨论 46-50 一 MLO-Y4细胞的转染 46 二 SSH成功的必要条件 46-48 三 测序结果分析 48 四 Cbfa1在两种成骨细胞中诱导Osx的表达 48-50 结论 50-51 英文摘要 51-53 参考文献 53-57 致谢 57-58 独创性声明 58
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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