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开放Kir6.2-K_ATP通道对MPP~+所致中脑神经元损伤的保护作用及其机制研究

作　者: 谢娟
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: ATP敏感性钾通道 ATP敏感性钾通道开放剂中脑神经元活性氧簇 1-甲基-4-苯基-吡啶离子
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性死亡以及纹状体DA含量的绝对减少是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理基础。据此,PD的临床治疗主要采用左旋多巴(levodopa,L-DOPA)替代治疗,但该疗法仅能缓解症状,并不能阻止病程的进展,且长期使用导致严重的不良反应。目前,对于导致DA能神经元变性、死亡的确切机制仍不清楚。研究认为,兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化应激、炎症等多种病理损伤可能参与PD的发生发展。其中,线粒体氧化应激在中脑DA能神经元死亡中发挥着重要的作用。氧化应激是指活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态,当ROS生成超过抗氧化防御系统和/或当抗氧化剂活性降低时发生。线粒体是ROS产生的主要场所,同时也是氧化应激的主要损伤靶标。过量ROS的生成可导致线粒体膜系统损伤,降低线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm),开放线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,PTP),进而释放促凋亡蛋白,触发线粒体途径的凋亡通路。线粒体功能障碍以及由线粒体介导的神经细胞凋亡在神经退行性疾病发生、发展中起了重要的作用。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels,KATP)是一类耦联细胞代谢和电活动、以细胞内ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。脑内KATP通道的分子组成具有多样性,大多数神经元上表达Kir6.2亚基构成的KATP通道(Kir6.2-KATP),而在胶质细胞上主要表达Kir6.1亚基构成的KATP通道。本实验室前期研究显示,KATP通道开放剂可通过抗兴奋性毒性、抗凋亡、抑制神经炎症和恢复线粒体功能等途径在多种PD动物模型中发挥神经保护作用,因而提出KATP通道是神经保护的理想靶标。然而,对于开放神经元上的Kir6.2-KATP通道在DA能神经元损伤中的保护作用仍缺乏直接的证据。目的:探讨开放Kir6.2-KATP通道对生物毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)所致中脑神经元损伤的保护作用及其机制。方法:应用Kir6.2基因敲除C57BL/6J小鼠,分离、培养野生型(Kir6.2+/+)、基因敲除型(Kir6.2-/-)小鼠中脑神经元。给予三种不同亚基敏感性的KATP通道开放剂(KATP channel openers,KCOs)及MPPP+药物处理,通过检测培养基中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量、观察Hochest33342核染色以及酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫细胞化学染色,研究KCOs对MPP+诱导损伤后的原代培养中脑神经元尤其是DA能神经元的保护作用。应用2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA),5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯丙咪唑羰花青碘化物(JC-1)以及Western blot方法检测ROS含量,ΔΨm变化以及线粒体细胞色素c(cytochrome c,cyto c)释放,以探讨KCOs发挥保护作用的机制。结果:1)MPP+呈浓度依赖性地损伤原代培养的Kir6.2+/+、Kir6.2-/-中脑神经元,但对Kir6.2+/+神经元的损伤作用较Kir6.2-/-神经元显著;2)吡那地尔(pinacidil,Pin)和二氮嗪(diazoxide,Dia)预处理减轻MPP+对Kir6.2+/+神经元的损伤作用,而克罗卡林(cromakalim,Cro)则无此效应;三种KCOs均不能减轻MPP+对Kir6.2-/-中脑神经元的损伤;3)MPP+增加两种基因型神经元ROS的产生,降低ΔΨm并诱导线粒体cyto c的释放;Pin和Dia预处理能抑制MPP+诱导的Kir6.2+/+神经元内ROS的产生,维持ΔΨm,减少cyto c的释放,而Cro则无上述作用。KCOs对MPP+所致Kir6.2-/-中脑神经元的上述变化无影响。结论:1)预先开放Kir6.2-KATP通道可显著减弱MPP+诱导的中脑神经元的损伤,其机制与抑制MPP+诱导的ROS产生、稳定ΔΨm、减少cyto c的释放相关; 2)Kir6.2基因敲除减弱MPP+诱导的中脑神经元的损伤,为Kir6.2-KATP通道参与MPP+诱导的中脑神经元损伤提供了直接证据。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-20
材料与方法  20-25
结果  25-36
讨论  36-39
结论  39-40
参考文献  40-49
附录  49-50
  攻读学位期间发表文章情况  49-50
综述  50-66
  参考文献  59-66
致谢  66

开放Kir6.2-K_ATP通道对MPP~+所致中脑神经元损伤的保护作用及其机制研究

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