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非人灵长类动物隐孢子虫流行病学调查及部分分离株种类鉴定和基因分型

作　者: 李家诚
导　师: 张龙现；何国声；宁长申
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 隐孢子虫 18S rRNA 非人灵长类动物巢式PCR 种系发育
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本研究对我国部分地区非人灵长类动物隐孢子虫感染情况进行详细调查,获得52个灵长类动物隐孢子虫分离株。对5个分离株进行nested -PCR检测和PCR-RFLP分析;基于核糖体小亚基(SSU rRNA)基因的种类与基因型分析,鉴定非人灵长类动物隐孢子虫分离株种类和基因型,确定非人灵长类动物隐孢子虫分离株和其他种类隐孢子虫之间的分子种系进化关系,探讨非人灵长类动物隐孢子虫病的感染来源和传播机制,为进一步研究非人灵长类动物隐孢子虫的重要性提供理论基础。1、为了了解非人灵长类动物隐孢子虫感染情况,用改良抗酸染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法检查了上海,广西贵港,湖南长沙,海南三亚,四川成都和北京等地非人灵长类动物粪便样品739份。其中有52份样品呈隐孢子虫阳性,感染率为7.04%(52/739)。其中,用改良抗酸染色法检查的142份样品阳性检出率为18.31%(26/142),饱和蔗糖漂浮法检查的597份样品阳性检出率为4.36%(26/597)。调查结果表明,不同地区的隐孢子虫感染率有所不同,不同时间调查的样品阳性检出率也不一样。根据卵囊形态和大小,初步判断感染非人灵长类动物的隐孢子虫主要是微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)。2、利用巢式PCR扩增到5个非人灵长类隐孢子虫分离株18S rRNA基因部分片段,PCR产物经过连接转化,挑选阳性克隆进行测序,产物序列长度均在830-840bp;用限制性内切酶SspI对PCR产物进行消化酶切确定种类和基因型。SspI酶切结果:1个隐孢子虫分离株酶切后在450bp左右和380-390bp处有2个条带,对比酶切片段图谱可以发现,1号样品与C. muris相近;另外4个样品在100bp左右,250bp左右,450bp左右处有3个条带,根据酶切图谱,与C. parvum或者C.hominis相近。3、对5个非人灵长类动物隐孢子虫分离株进行nested-PCR核糖体小亚基(18S rRNA)基因扩增、克隆、测序,序列长度均为830bp左右。利用Clustal X、phylip 3.67软件进行种系发育分析,利用Treeview 1.65绘制进化树,同时利用DNAstar4.0进行同源性分析。结果显示5个分离株可以分为2个群,一个和C. muris等胃部寄生的隐孢子虫在一个群上,另外4个和C.parvum等肠道寄生的隐孢子虫在一个群上。同源性分析显示,SH01号分离株与GenBank上下载的C. muris的同源性为99.3%;其它4个分离株与C.parvum monkey genotype同源性分别为99.2%,99.8%,99.9%和99.4%。基于PCR-RFLP分析和基因型与基因亚型的种系发育分析,鉴定出本研究获得的非人灵长类动物隐孢子虫分离株一个为C. muris-like,另外4个为C.parvum monkey genotype。其中关于非人灵长类感染C. muris-like的分子生物学依据,是首次发现。本研究对于了解非人灵长类动物和其他哺乳动物隐孢子虫感染之间的关系,寻找人类隐孢子虫感染来源以及正确评估人与非人灵长类动物亲密活动的安全性,提供了理论基础。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-7
文献综述野生动物寄生虫感染情况调查研究进展  7-10
  1 原虫  7-8
  2 蠕虫  8-9
  3 体外寄生虫  9-10
文献综述微小隐孢子虫研究进展  10-16
  1 微小隐孢子虫概述  10-11
  2 微小隐孢子虫分类进展  11-14
  3 微小隐孢子虫的基因亚型分析  14-15
  4 微小隐孢子虫的流行病学  15
  5 结语  15-16
第一部分非人灵长类动物隐孢子虫感染情况调查  16-21
  1 引言  16
  2 材料与方法  16-17
  3 结果与分析  17-19
  4 结论与讨论  19-21
第二部分非人灵长类动物隐孢子虫分离株185 rRNA 基因巢氏 PCR-RFLP 鉴定  21-28
  1 引言  21
  2 材料与方法  21-24
  3 结果与分析  24-26
  4 结论与讨论  26-28
第三部分基于185 rRNA 基因的隐孢子虫种系发育关系研究  28-37
  1 引言  28
  2 材料与方法  28-31
  3 结果与分析  31-35
  4 结论与讨论  35-37
参考文献  37-45
英文摘要  45-46

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