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水稻抗白叶枯病基因Xa30（t）分子标记定位和抗病虫基因聚合研究

作　者: 梁云涛
导　师: 刘丕庆；赵开军
学　校: 广西大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻白叶枯病稻褐飞虱 Xa30(t) Bph18(t) 分子标记定位基因聚合
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

水稻是世界上重要的粮食作物,也是受病虫害威胁较严重的作物。水稻白叶枯病和稻褐飞虱则是危害水稻生产最严重的病虫害之一,给水稻生产造成巨大的产量损失,严重时甚至绝收。长期实践证明,利用寄主抗性、培育抗病虫品种是控制病虫害流行最经济、有效的方法,也符合现代农业可持续发展的要求。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae）引起的维管束病害。为了有效控制水稻白叶枯病的爆发和流行,至今已挖掘筛选出30多个抗白叶枯病主效基因,但由于抗谱窄,隐性特征等多种原因,只有少数基因被用于育种实践;而且曾广泛应用的抗白叶枯基因Xa3和Xa4在国内外各稻区现已丧失抗性。因此,各国科学家都致力于挖掘新的抗性基因。由于野生稻长期生长在恶劣环境中,含有丰富的抗逆、抗病虫害基因,是筛选新抗源的重要基因宝库。王春连等就从我国普通野生稻中发掘、鉴定了一个编号为Y238的新抗源,它具有抗谱广、高抗性等特点,经遗传分析证明其抗性是受一个新的显性基因控制;然后通过常规杂交、回交将抗病基因分别导入水稻品种金刚30和IR24中,建立了近等基因系CBB30,该抗病基因被命名为Xa30（t）。为了深入开展抗病分子机理研究和能在育种上有效利用,定位和克耎a30（t）基因就显得非常重要。2006年,金旭炜等以金刚30/Y238的杂交后代的F2群体为定位群体,使用分子标记方法将Xa30（t）初步定位在第11号染色体长臂上。本研究将以IR24/Y238转育近等基因系的一个BC₆F₂株系为定位群体,使用分子标记方法对Xa30（t）进行定位,进一步确定其在水稻染色体上的位置。水稻在面临病害威胁的同时,也受到害虫的危害,尤其是稻褐飞虱。稻褐飞虱（Nilaparvam lugens St（?）l）是一种单食性水稻害虫,属同翅目,飞虱科（Homoptera Delphacidae）。稻褐飞虱分布面积广,危害性大,世界上大部分稻区均有发生,我国的发生情况也非常严重。长期以来,育种家和遗传学家努力筛选新抗源,挖掘新抗虫基因,将其导入栽培稻培育高抗新品种来控制虫害的发生。但由于抗性鉴定困难、常规选育周期长等原因,导致培育抗虫新品种的进程缓慢。而且,我国稻褐飞虱群体已由生物型1为主逐步转变为以生物型2为主,使得原有抗虫品种将会丧失抗性。为提高选择效率、加快育种进程,本研究利用分子标记辅助选择技术,将高抗白叶枯病的Xa23基因和对我国稻褐飞虱生物群体表现为高抗的Bph18（t）基因聚合,导入到优质杂交水稻恢复系9311和测253中,选育优质高抗的水稻中间材料。本研究已获得以下主要结果:1、培育一个IR24/Y238的转育后代BC₆F₂群体,用白叶枯病菌P6接种鉴定,群体在苗期、成株期抗感比均符合3:1分离。表明该群体抗病性是受一个显性基因控制,因此,将其确定为Xa30（t）基因的定位群体。利用分布于于水稻12对染色体上的SSR、EST、STS和特异PCR标记,通过分离集团分析法（BSA）在F₂群体的抗感池间共筛选到6个多态性标记03STS、Lj74/Y02W1R、A83b4、Lj 112、Lj 121和RM206。通过对F₂群体单株进行分子检测,然后综合分析,将Xa30（t）定位在标记03 STS和Lj 112之间,并与标记A83b4共分离,完全覆盖水稻测序品种日本晴的BAC克隆AC104847、AC137588,部分覆盖BAC克隆AC136148和AC137589,约412kb。2、根据Bph18（t）共分离分子标记7314.T4A扩增片断的序列信息,利用分子生物信息学技术开发出3个与Bph18（t）基因紧密连锁的PCR标记KC5、KC1F/7312.T4AR和7312.T4AF/KC2R。以携有Xa23基因的杂交稻恢复系9311和测253为轮回亲本,携有Bph18（t）基因的籼稻材料4064为非轮回亲本进行杂交和多代回交,用KC5、KC1F/7312.T4AR和7312.T4AF/KC2R标记和Xa23基因紧密连锁标记STS2F/3R进行抗病虫基因的分子检测,并结合每代用P6菌鉴定,现将Bph18（t）和Xa23基因同时导入到轮回亲本中,获得以9311为遗传背景的BC₃F₁材料和以测253为遗传背景的BC₃F₁材料。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-14
1 前言  14-36
  1.1 水稻抗白叶枯病研究进展  14-21
    1.1.1 水稻白叶枯病概况  14-15
    1.1.2 水稻白叶枯病原菌研究进展  15-16
    1.1.3 水稻抗白叶枯病基因遗传研究  16-17
    1.1.4 水稻抗白叶枯病基因分离与克隆  17-21
  1.2 水稻抗褐飞虱研究进展  21-28
    1.2.1 稻褐飞虱的生物学特征及分布情况  21
    1.2.2 褐飞虱生物型研究  21-23
    1.2.3 稻褐飞虱的危害性  23
    1.2.4 水稻抗褐飞虱基因遗传研究  23-27
    1.2.5 致害基因与抗虫基因的关系  27-28
  1.3 分子标记研究现状  28-34
    1.3.1 常见的几种分子标记的原理及特征  28-31
    1.3.2 分子标记的应用  31-34
  1.4 水稻抗病虫害分子标记辅助育种研究进展  34-35
    1.4.1 回交转育  34
    1.4.2 基因聚合  34-35
  1.5 本研究的目的意义  35-36
2 水稻抗白叶枯病基因Xa30(t)的分子标记定位  36-55
  2.1 材料和方法  36-46
    2.1.1 水稻材料  36
    2.1.2 水稻白叶枯菌系  36-37
    2.1.3 SSR标记及其引物  37
    2.1.4 EST标记及其引物  37
    2.1.5 STS标记及其引物  37
    2.1.6 特异PCR标记及其引物  37
    2.1.7 水稻白叶枯菌接种调查  37
    2.1.8 基因组DNA的提取  37-39
    2.1.9 SSR引物PCR反应程序  39
    2.1.10 EST标记、STS标记及自行设计的特异引物的PCR程序  39-40
    2.1.11 PCR产物的电泳检测  40-42
    2.1.12 新标记的开发  42
    2.1.13 特异片断的克隆  42-45
    2.1.14 标记与目的基因间的连锁分析  45-46
    2.1.15 物理图谱的构建  46
  2.2 结果与分析  46-54
    2.2.1 定位群体的抗性鉴定与遗传分析  46
    2.2.2 分子标记多态性分析  46
    2.2.3 Xa30(t)基因的初步定位  46-49
    2.2.4 特异引物的开发和多态性筛选  49-50
    2.2.5 特异标记的定位以及与Xa30(t)基因的连锁分析  50-52
    2.2.6 Xa30(t)基因座位的物理图谱  52-54
  2.3 小结  54-55
3 分子标记辅助聚合水稻抗病虫基因的研究  55-66
  3.1 材料和方法  56-60
    3.1.1 水稻材料  56
    3.1.2 水稻白叶枯菌系  56
    3.1.3 与抗性基因紧密连锁的分子标记  56
    3.1.4 水稻白叶枯菌接种鉴定  56
    3.1.5 基因组DNA的提取  56-57
    3.1.6 PCR扩增方法  57
    3.1.7 PCR产物的检测  57
    3.1.8 限制性内切酶HinfⅠ酶切反应  57-58
    3.1.9 特异片断的回收与测序  58
    3.1.10 开发与Bph18(t)基因紧密连锁的新标记  58-59
    3.1.11 抗病虫基因聚合实验方案  59-60
  3.2 结果与分析  60-65
    3.2.1 7312.T4A标记在亲本间多态性分析  60-61
    3.2.2 开发与Bph18(t)基因紧密连锁的新标记  61-64
    3.2.3 分子标记辅助聚合Xa23与Bph18(t)基因  64-65
  3.3 小结  65-66
4 全文结论与讨论  66-73
  4.1 全文结论  66
  4.2 全文讨论  66-71
    4.2.1 新抗病基因的挖掘和鉴定  66-67
    4.2.2 Xa30(t)基因的分子标记定位  67-68
    4.2.3 水稻白叶枯病抗性基因的表达  68
    4.2.4 生物信息学分析技术的应用  68-69
    4.2.5 分子标记辅助选择与基因聚合  69-70
    4.2.6 PCR分子标记在分子标记辅助选择中的应用  70-71
  4.3 下一步工作设想  71-73
致谢  73-74
参考文献  74-82
附录  82

水稻抗白叶枯病基因Xa30（t）分子标记定位和抗病虫基因聚合研究

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