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干酪乳杆菌D400产ACE抑制肽的研究

作　者: 张子健
导　师: 张柏林
学　校: 河北农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 干酪乳杆菌蛋白水解活力 ACE抑制活性发酵乳耐受胃肠环境氨基酸含量
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

ACE抑制肽具有降血压功能,采用酶解或微生物发酵是目前获取乳源性ACE抑制肽的主要手段。干酪乳杆菌属于同型发酵乳酸菌,有较好的产酸活性及蛋白水解活力,广泛用于多种乳制品生产上。本文从ACE抑制活性菌株的筛选和鉴定、发酵乳ACE抑制率的影响因素、ACE抑制肽的胃肠耐受性及乳酸菌产ACE抑制肽的机制等方面对干酪乳杆菌的ACE抑制活性进行了研究,旨在为应用干酪乳杆菌到相关食品中提供依据。主要研究结果如下:1、D400和Y5-2b在经pH=2.5的人工胃液消化4 h后,活菌率仍能达到89.09%和86.28%,而经过人工肠液和0.3%胆盐消化后活菌率则仍能达到96%~98%,均表现为良好的耐胃肠环境性能。D400无论在乳中的生长状态,发酵性能还是蛋白水解活力方面都优于Y5-2b,ACE抑制活性试验证明, D400发酵乳的ACE抑制率高于Y5-2b。因此D400被选作本次研究的试验菌株。基于生理生化和16S rRNA基因序列的试验数据,乳杆菌D400被鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。2、随着L.casei D400细胞生物量和发酵乳滴定酸度的上升,菌株的蛋白水解活力以及对ACE的抑制率随之上升,表明随着菌株生长,含在乳蛋白中的ACE抑制肽逐渐被释放出来,菌株的蛋白水解活力与ACE抑制活性有着明显的相关性。3、单因素试验表明,发酵温度、发酵时间和无脂乳固形物浓度都会影响菌株的蛋白水解活力,影响其ACE抑制效率。优化后的L.casei D400在乳中的发酵条件是:无脂乳固形物浓度为10%,发酵时间为24 h,发酵温度为37°C,在这样的条件下,L.casei D400的ACE抑制率是81.15%。4、模拟胃肠环境试验结果表明,经胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用后,L.casei D400的ACE抑制率由消化前的81.15%下降到消化后的67.83%,下降程度不是很大,说明L.casei D400产生的ACE抑制肽具有一定的耐受胃肠道内蛋白酶消化能力。5、对L.casei D400发酵乳中的氨基酸组分与含量分析表明,疏水性氨基酸含量在总氨基酸中的比重也由发酵前的22.29%上升为48.50%,脯氨酸含量在总氨基酸中的比重大幅上升,由发酵前的1.67%上升为18.75%,且相对增加量高于其它氨基酸。亮氨酸和苏氨酸的含量相对增加较多,异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸其次,且新生成了蛋氨酸和苯丙氨酸,结合已知ACE抑制肽的序列结构,符合了产ACE抑制肽的条件。因此,L.casei D400产ACE抑制肽的原因是其具有水解蛋白产生脯氨酸及其他疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的能力。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-18
  1.1 高血压概况  10-11
    1.1.1 高血压定义及发病机理  10
    1.1.2 高血压的药物治疗  10-11
  1.2 血管紧张素转化酶在血压调节中的作用  11
    1.2.1 血管紧张素转化酶  11
    1.2.2 血管紧张素转化酶在血压调节中的作用  11
  1.3 ACE 抑制肽  11-12
    1.3.1 ACE 抑制肽的降血压原理  11-12
    1.3.2 ACE 抑制肽的作用特点  12
    1.3.3 天然来源ACE 抑制肽的研究进展  12
  1.4 乳酸菌发酵乳制品降血压功能的研究进展  12-16
    1.4.1 乳酸菌发酵乳制品的降血压作用  12-13
    1.4.2 乳源ACE 抑制肽的研究进展  13-15
    1.4.3 乳源ACE 抑制肽结构与功能的关系  15
    1.4.4 发酵牛乳产生降血压肽的乳酸菌  15-16
  1.5 干酪乳杆菌的益生作用  16
  1.6 研究中存在的问题  16
  1.7 立题依据及研究内容  16-17
  1.8 技术路线  17-18
2 材料与方法  18-29
  2.1 菌株来源  18
  2.2 培养基  18-20
    2.2.1 MRS 培养基  18
    2.2.2 12%的复原脱脂乳  18
    2.2.3 鉴定培养基  18-20
  2.3 主要试剂及仪器设备  20-21
    2.3.1 重要试剂及材料  20
    2.3.2 仪器设备  20-21
  2.4 ACE 抑制活性乳杆菌的筛选  21-25
    2.4.1 菌株的耐受胃肠环境试验  21-22
    2.4.2 菌株的凝乳特性  22
    2.4.3 强化发酵乳的凝乳特性  22
    2.4.4 发酵乳产酸曲线的测定  22
    2.4.5 发酵乳中乳酸菌生物量测定  22
    2.4.6 发酵乳中蛋白水解度的测定  22-23
    2.4.7 发酵乳产多肽含量的测定  23-24
    2.4.8 发酵乳ACE 抑制活性的体外检测  24-25
  2.5 乳杆菌D400 和Y5-2b 的鉴定  25-26
    2.5.1 菌株活化  25
    2.5.2 菌落特征及形态观察  25
    2.5.3 生理特征测定  25
    2.5.4 生化特征测定  25-26
    2.5.5 分子生物学方法——16S rRNA 扩增及序列测定  26
  2.6 菌株发酵乳ACE 抑制率的动力学分析  26
  2.7 影响L.casei D400 发酵乳ACE 抑制活性的因素  26-27
    2.7.1 发酵时间对发酵乳ACE 抑制活性的影响  26
    2.7.2 发酵温度对发酵乳ACE 抑制活性的影响  26-27
    2.7.3 无脂乳固形物浓度对发酵乳ACE 抑制活性的影响  27
    2.7.4 影响发酵乳ACE 抑制活性的综合因素  27
  2.8 胃肠消化对ACE 抑制活性的影响  27
    2.8.1 乳清的制备  27
    2.8.2 ACE 抑制肽对胃肠消化的抗性试验  27
  2.9 菌株产ACE 抑制肽机制的初步探讨  27-28
    2.9.1 氨基酸分析的样品前处理  27-28
    2.9.2 氨基酸含量测定  28
  2.10 数据分析  28-29
3 结果与分析  29-41
  3.1 具有ACE 抑制活性乳杆菌的筛选  29-32
    3.1.1 菌株的耐受胃肠环境试验  29-30
    3.1.2 菌株在牛乳中的凝乳状态  30
    3.1.3 菌株D400 和Y5-2b 的发酵性能  30-31
    3.1.4 菌株的蛋白水解活力  31-32
    3.1.5 发酵乳的ACE 抑制率  32
  3.2 乳杆菌D400 和Y5-2b 的鉴定结果  32-34
    3.2.1 形态学特征  32-33
    3.2.2 生理生化鉴定结果  33-34
    3.2.3 16S rRNA 基因序列分析结果  34
  3.3 L.casei D400 发酵乳ACE 抑制率的动力学分析  34-35
  3.4 影响ACE 抑制率的因素  35-38
    3.4.1 发酵时间对ACE 抑制率的影响  35-36
    3.4.2 发酵温度对ACE 抑制率的影响  36
    3.4.3 无脂乳固形物浓度对发酵乳ACE 抑制活性的影响  36-37
    3.4.4 影响ACE 抑制率的综合因素分析  37-38
    3.4.5 验证试验  38
  3.5 胃肠消化对ACE 抑制活性的影响  38-39
  3.6 菌株产ACE 抑制肽机制的初步探讨  39-41
4 讨论  41-45
  4.1 益生菌对消化道环境的耐受力  41
  4.2 菌株蛋白水解活力与ACE 抑制活性的关系  41
  4.3 影响干酪乳杆菌发酵乳ACE 抑制活性的因素  41-42
    4.3.1 发酵时间的影响  41-42
    4.3.2 发酵温度的影响  42
    4.3.3 无脂乳固形物浓度的影响  42
  4.4 ACE 抑制肽的胃肠消化耐受性  42
  4.5 乳酸菌产ACE 抑制肽的机制  42-44
  4.6 研究前景  44-45
5 结论  45-46
参考文献  46-51
附录  51-60
在读期间发表的学术论文  60-61
作者简历  61-62
致谢  62-63

干酪乳杆菌D400产ACE抑制肽的研究

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