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MicroRNA-134和Limk1在FMR1基因敲除鼠脑组织的表达

作　者: 曾志涌
导　师: 易咏红
学　校: 广州医学院
专　业: 神经病学
关键词: 脆性X综合征 LIM-kinase 1(Limk1) microRNA-134(miR-134) 脆性X智力低下蛋白( FMRP) 树突棘
分类号: R749.94
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 140次
引　用: 2次
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内容摘要

脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下性疾病,临床表现主要有不同程度的智力障碍、青春期后巨大睾丸,部分患者有特征性面容,如长脸、招风耳、高腭弓,以及自闭症等精神行为异常。FXS是由脆性X智障基因(fragile X mental retardation 1,FMR1)5,端非编码区(CGG)n三核苷酸重复序列不稳定扩增及其相邻部位CpG岛异常甲基化,使FMR1基因失活,导致其编码的产物--脆性X智力低下相关蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)表达的减少或缺失引起。其主要病理改变为树突棘呈明显瘦长、扭曲的幼稚形态。由于树突棘是突触后膜的主要结构因此普遍认为树突棘形态异常导致的突触可塑性改变可能是导致FXS临床表现的病理基础。研究表明FMRP是一种mRNA结合蛋白,主要起翻译抑制子的作用,负性调节与发育相关的蛋白表达,但FMRP减少或缺失后如何引起树突棘等一系列异常表现的分子机制并未明确。目前的研究发现同样具有基因转录后表达抑制活性的microRNA(miRNA)和FMRP可能共同参与了FXS发病机制。FMRP和miRNA都是RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)的成分,起沉默基因、调控表达的作用。进一步的研究发现microRNA-134(miR-134)通过负性调控Limk1蛋白的表达影响树突棘发育。本研究利用FMR1基因敲除的脆性X综合征小鼠模型,通过观察miR-134和Limk1蛋白在不同发育时期不同部位脑组织的表达差异,以明确FMRP缺失是否导致miR-134沉默Limk1 mRNA的功能降低,从而影响树突棘发育。该研究有助于明确脆性X综合征的发病机理。材料与方法:取FVB品系新生鼠和生后2、6周雄性FMR1基因敲除小鼠( FMR1 knockout mouse KO,KO0d、KO2W和KO6W)用于研究,并分别采用同龄野生雄性小鼠(wild type mouse WT,WT0d、WT2W和WT6W)作对照。每组11只,其中6只用于免疫组化染色,观察Limk1在不同年龄组的KO和WT小鼠脑组织各部位的表达差异;另外5只用于qRT-PCR观察不同年龄组的KO和WT小鼠脑组织miR-134转录量的差异。小鼠饲养在19～21℃自然光条件下,自由获取食物和水分。实验前取尾部提取DNA,PCR技术进行基因型鉴定。结果:1.不同发育时期Limk1在不同脑区的表达特点免疫组化的结果显示:Limk1蛋白在新生鼠的海马、皮层、丘脑、小脑表达丰富,以染色阳性纤维为主,染色阳性细胞少见。生后2周、6周小鼠的大脑皮质和海马仅见少量散在弱阳性细胞表达,但在丘脑未定带、腹后外侧核,小脑蒲肯野细胞和脑干前庭蜗神经核可见强阳性细胞表达。2. KO和WT小鼠Limk1表达量的差异各年龄组KO与WT小鼠Limk1在脑区的分布特点基本一致。KO0d、KO2W及KO6W组小脑、蜗神经核Limk1强阳性表达脑区的平均光密度值以及KO2W及KO6W组丘脑部位的阳性细胞计数均高于同龄WT组,差异有统计学意义(P值均<0.05)。3. KO和WT小鼠脑组织miR-134转录水平差异KO0d、KO2W和KO6W组小鼠与同龄组WT小鼠脑组织中miR-134转录水平进行比较,差异均无统计学意义(P >0.05)。4.不同发育时期脑组织中miR-134的转录水平6周龄KO和WT组小鼠miR-134的转录表达量较相同基因型新生组和2周龄组明显降低,差异有统计学意义(P <0.05)。新生组和2周龄组小鼠的miR-134转录表达量差异无统计学意义(P >0.05)。结论:Limk1在FMR1基因敲除鼠及野生小鼠脑组织的表达均有着明显的时空特异性。miR-134的转录在新生至2周的神经系统发育期间维持着较高水平,至成年期则下降。两者均提示在其调控神经系统发育中可能起着重要作用。在不同发育时期,KO鼠海马、皮层、丘脑和小脑等部位的Limk1表达均显著高于WT鼠,表明FMRP负性调控Limk1表达。由于miR-134的转录表达量在同龄KO与WT组小鼠差异无统计学意义,提示FMRP可能是通过影响miR-134的功能而调控Limk1。

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中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-13
材料与方法  13-26
结果  26-32
讨论  32-38
参考文献  38-43
缩略词表  43-50
综述  50-55
参考文献  55-60
致谢  60-61

MicroRNA-134和Limk1在FMR1基因敲除鼠脑组织的表达

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