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树枝状大分子用于氨基酰化酶的固定化研究

作　者: 高翔
导　师: 杨屹
学　校: 北京化工大学
专　业: 分析化学
关键词: 聚酰胺-胺 氨基酰化酶 固定化酶 N-乙酰-DL-蛋氨酸 毛细管区带电泳
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


树枝状大分子（Dendrimer）是一类新型的功能高分子化合物,它的特点是可以在分子水平进行分子的大小、形状和功能基团的设计。把树枝状大分子引到硅胶表面,可以大大增加硅胶的表面积、容量和选择性。固定化酶具有稳定性好、可重复并连续使用等优点,克服了游离酶对环境敏感、性质不稳定、易失活或死亡等缺点。聚酰胺-胺（PAMAM）作为一种性能优良的树枝状大分子,可作为酶的固定化载体,利用其自身的特点,提高单位面积内固定化酶量。本文采用发散合成法,使用直径50μm的硅胶,经过氢氧化钠、去离子水、盐酸处理后,以3-氨丙基-三乙氧基硅烷（APTES）作为硅烷化试剂,通过丙烯酸甲酯与APTES的端氨基发生Micheal加成反应,得到0.5G的聚酰胺-胺（PAMAM）,之后端酯基与乙二胺发生酰胺化反应,得到1.0G的枝形大分子PAMAM表面修饰的硅胶,重复以上过程,制得2.0G、3.0G树枝状大分子表面修饰的硅胶。采用氨基滴定、核磁共振、扫描电镜、荧光显微镜和元素分析等手段对合成产物的结构和性能进行了表征,结果表明合成的树枝状大分子具有良好的性能。使用戊二醛交联氨基酰化酶与PAMAM,在戊二醛浓度为1%、交联时间4h、交联温度25℃的条件下固定氨基酰化酶,固定后的氨基酰化酶拥有较高的活性;以1.0G-3.0G树枝分子PAMAM分别与氨基酰化酶进行交联,发现固定化酶的活性呈逐代递增趋势。研究了pH、Co2+浓度和底物浓度对固定化酶活性的影响,结果表明,固定化氨基酰化酶的最佳反应条件为pH 7.5,温度65℃。比较了游离酶和固定化酶的热稳定性和储存稳定性,结果表明,固定化酶的热稳定性和储存稳定性远远好于游离酶。固定化酶的半衰期为34d。采用固定后的氨基酰化酶与N-乙酰-DL-蛋氨酸反应,用毛细管区带电泳（CZE）对酶解后的酶解液进行了研究。结果显示该固定化氨基酰化酶具有良好的效率、重现性和稳定性。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
CONTENTS  10-13
符号说明  13-14
第一章 前言  14-28
  1.1 树枝状大分子  14-21
    1.1.1 树枝状大分子PAMAM的组成及结构特点  15-16
    1.1.2 PAMAM的合成方法  16-18
    1.1.3 树枝状大分子的表征  18-20
    1.1.4 树枝状大分子的功能化  20
    1.1.5 树枝状大分子的应用  20-21
  1.2 酶的固定化技术  21-26
    1.2.1 固定化酶概述  21-22
    1.2.2 酶的固定化方法  22-25
    1.2.3 固定化酶载体材料的性能要求  25-26
    1.2.4 常用的固定化酶载体材料  26
  1.3 本课题的提出  26-28
第二章 PAMAM表面修饰硅胶的合成和表征  28-38
  2.1 前言  28
  2.2 仪器和试剂  28-30
    2.2.1 实验仪器  28-29
    2.2.2 实验试剂  29-30
  2.3 PAMAM表面修饰硅胶的合成  30-32
    2.3.1 合成路线  30-31
    2.3.2 PAMAM表面修饰硅胶的合成步骤  31-32
  2.4 PAMAM表面修饰硅胶的表征  32-37
    2.4.1 氨基滴定  32-33
    2.4.2 固体~(13)C核磁共振谱图  33-34
    2.4.3 扫描电子显微镜(SEM)图像  34-35
    2.4.4 荧光显微镜(FM)图像  35-36
    2.4.5 元素分析(EA)  36-37
  2.5 结论  37-38
第三章 氨基酰化酶的固定化研究  38-48
  3.1 前言  38
  3.2 仪器和试剂  38-39
    3.2.1 实验仪器  38-39
    3.2.2 实验试剂  39
  3.3 实验方法  39-40
    3.3.1 戊二醛交联实验  39-40
    3.3.2 氨基酰化酶相对酶活的测定  40
  3.4 结果与讨论  40-47
    3.4.1 戊二醛交联反应最优条件的选择  40-43
    3.4.2 0G-3.0G PAMAM表面修饰硅胶为基体的固定化酶相对酶活比较  43-44
    3.4.3 固定化酶对N-乙酰-DL-蛋氨酸的酶解研究  44-46
    3.4.4 固定化酶的稳定性研究  46-47
  3.5 结论  47-48
第四章 固定化酶酶解体系的毛细管电泳研究  48-54
  4.1 前言  48
  4.2 仪器和试剂  48-50
    4.2.1 实验仪器  48-49
    4.2.2 实验试剂  49-50
  4.3 实验方法  50
  4.4 结果与讨论  50-52
    4.4.1 三种物质标样的出峰时间  50-51
    4.4.2 固定化酶酶解体系的毛细管电泳分离  51-52
  4.5 结论  52-54
第五章 结论  54-56
参考文献  56-62
致谢  62-64
研究成果及发表的学术论文  64-66
导师和作者简介  66

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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