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Asp60对肌红蛋白结构和功能的影响

作　者: 王影
导　师: 王静云
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 肌红蛋白定点突变结构稳定性 Cu2+ 过氧化物酶活性
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 55次
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内容摘要

为了进一步了解肌红蛋白Mb表面第60位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能以及与Cu²⁺相互作用的影响,本论文以含有编码马心肌红蛋白双突变位点（第44位和60位天冬氨酸突变为赖氨酸）基因的表达质粒pGYM为模板,设计特异性突变引物,通过PCR定点突变的方法将第44位的碱性氨基酸赖氨酸（K）密码子突变成酸性氨基酸天冬氨酸（D）密码子,获得肌红蛋白突变体D60K的基因。将带有突变体的目的基因克隆连接到表达质粒pGYM上,经热激转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌培养使突变蛋白D60K大量表达,收集菌体,酶法裂解细菌,并依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白,其纯度可达96%。用圆二色谱和紫外-可见吸收光谱法分别研究野生型肌红蛋白Mb（WT）及突变体（D60K）的耐热、耐酸及耐盐酸胍诱导的变性过程,结果表明:用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp60,降低了肌红蛋白的耐热能力,导致其热变性中点温度Tm由68.1℃降低到66.4℃;提高了肌红蛋白的耐酸变性和耐盐酸胍变性能力,导致其变性中点（pH）_1/2从4.32降到4.19、盐酸胍变性中点浓度Cm从1.95mM提高2.10mM。在研究突变位点对肌红蛋白与Cu²⁺相互作用的影响时,综合运用了紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱以及圆二色光谱。紫外-可见吸收光谱研究表明:Cu²⁺使Mb（D60K）的紫外吸收增强,峰位蓝移,疏水基团之间的作用力减弱;荧光光谱研究表明:Cu²⁺与Mb（D60K）相互作用时形成1:1的复合物且其猝灭机制属于静态猝灭,并由Van’t Hoff方程计算的ΔH、ΔS判断出二者之间的作用力主要表现为静电力,另外依据F（o|¨）rster非辐射能量转移理论计算出给体-受体间的结合距离为2.48 nm;同步荧光光谱研究表明,Cu²⁺使Mb（D60K）色氨酸残基的疏水性下降;CD光谱研究表明:加入Cu²⁺后,蛋白α-螺旋含量降低。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb（WT）和Mb（D60K）的过氧化物酶活性,结果表明:Mb（D60K）的Km为2.19mM而Mb（WT）的Km为1.26mM。Mb（WT）和Mb（D60K）作为过氧化物酶的最适反应温度均为60℃左右,在相同温度下,Mb（D60K）的过氧化物酶活性低于Mb（WT）,且其作为过氧化物酶的热稳定性低于Mb（WT）。此外,两者作为过氧化物酶的最适反应pH均在5.5左右。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
引言  11-13
1 文献综述  13-31
  1.1 引言  13
  1.2 肌红蛋白的结构  13-15
  1.3 肌红蛋白结构和功能研究的现状  15-20
    1.3.1 氨基酸选择性突变  16-17
    1.3.2 血红素化学修饰  17
    1.3.3 氨基酸选择突变和血红素修饰相结合  17-18
    1.3.4 非天然辅基引入  18-19
    1.3.5 电极上的直接电化学  19-20
    1.3.6 与小分子或金属离子的相互作用  20
  1.4 PCR定点突变  20-22
    1.4.1 利用PCR在基因的5'或3'末端产生突变  21
    1.4.2 利用重叠延伸PCR技术在基因的中心区段产生取代突变  21-22
  1.5 蛋白的分离纯化方法  22-23
    1.5.1 凝胶过滤层析(GC)  22
    1.5.2 离子交换层析(IEC)  22-23
    1.5.3 疏水作用层析(HIC)  23
    1.5.4 金属离子亲和层析(IMAC)  23
  1.6 蛋白质结构的研究方法  23-30
    1.6.1 圆二色性光谱法  24-27
    1.6.2 荧光光谱  27-28
    1.6.3 紫外-可见吸收光谱  28
    1.6.4 核磁共振法  28-29
    1.6.5 X射线衍射结构分析法  29-30
  1.7 本论文的工作  30-31
2 突变体Mb(D60K)的构建  31-41
  2.1 引言  31
  2.2 实验材料  31-32
    2.2.1 实验仪器  31
    2.2.2 实验试剂  31
    2.2.3 培养基和储备液  31-32
    2.2.4 引物的设计与合成  32
  2.3 实验方法  32-38
    2.3.1 质粒提取  32-33
    2.3.2 PCR定点突变  33-35
    2.3.3 PCR产物的回收  35
    2.3.4 酶切载体和目的基因  35-36
    2.3.5 酶切反应物的精制  36
    2.3.6 载体与目的基因的连接  36
    2.3.7 感受态细胞的制备  36-37
    2.3.8 转化  37
    2.3.9 阳性克隆的筛选  37-38
    2.3.10 DNA测序  38
  2.4 结果与讨论  38-40
  2.5 小结  40-41
3 突变体Mb(D60K)的表达、分离与纯化  41-45
  3.1 引言  41
  3.2 实验材料  41
    3.2.1 实验仪器  41
    3.2.2 实验试剂及缓冲液  41
  3.3 实验方法  41-43
    3.3.1 蛋白质的表达  41-42
    3.3.2 总蛋白溶液的获取  42
    3.3.3 总蛋白的粗提  42
    3.3.4 肌红蛋白的精制  42-43
  3.4 肌红蛋白浓度的测定  43-44
  3.5 结果与讨论  44
  3.6 小结  44-45
4 肌红蛋白及其突变体(D60K)结构稳定性的研究  45-51
  4.1 引言  45
  4.2 实验材料  45
    4.2.1 实验仪器  45
    4.2.2 实验试剂  45
  4.3 实验方法  45-46
    4.3.1 热诱导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  45
    4.3.2 pH介导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  45-46
    4.3.3 盐酸胍诱导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  46
  4.4 结果与讨论  46-50
    4.4.1 热诱导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  46-48
    4.4.2 pH介导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  48-49
    4.4.3 盐酸胍诱导的Mb(WT)和Mb(D60K)的去折叠研究  49-50
  4.5 小结  50-51
5 肌红蛋白突变体(D60K)与Cu~(2+)相互作用的研究  51-61
  5.1 引言  51
  5.2 实验材料  51-52
    5.2.1 实验仪器  51-52
    5.2.2 实验试剂  52
  5.3 实验方法  52
    5.3.1 紫外-可见吸收光谱的测定  52
    5.3.2 荧光光谱的测定  52
    5.3.3 同步荧光光谱测定  52
    5.3.4 圆二色光谱的测定  52
  5.4 结果与讨论  52-60
    5.4.1 紫外-可见吸收光谱  52-53
    5.4.2 荧光光谱  53-58
    5.4.3 同步荧光光谱  58-59
    5.4.4 圆二色光谱  59-60
  5.5 小结  60-61
6 肌红蛋白及其突变体(D60K)过氧化物酶活性的研究  61-67
  6.1 引言  61-62
  6.2 实验材料  62
    6.2.1 实验仪器  62
    6.2.2 实验试剂  62
  6.3 实验方法  62-63
    6.3.1 对愈创木酚Km值的测定  62
    6.3.2 Mb(WT)及Mb(D60K)过氧化物酶的最适温度和热稳定性  62
    6.3.3 Mb(WT)及Mb(D60K)过氧化物酶的最适pH和pH稳定性  62-63
  6.4 结果与讨论  63-66
    6.4.1 对愈创木酚Km值的测定  63
    6.4.2 Mb(WT)及Mb(D60K)过氧化物酶的最适温度和热稳定性  63-65
    6.4.3 Mb(WT)及Mb(D60K)过氧化物酶的最适pH和pH稳定性  65-66
  6.5 小结  66-67
7 结论与展望  67-69
  7.1 结论  67
  7.2 创新点  67-68
  7.3 展望  68-69
参考文献  69-75
附录缩略语表  75-76
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  76-77
致谢  77-78

Asp60对肌红蛋白结构和功能的影响

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