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转基因棉花基因组DNA的提取及抗冻蛋白基因Mpafp149的检测

作　者: 代春英
导　师: 马纪
学　校: 新疆大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉花昆虫抗冻蛋白基因花粉管导入法相对电导率丙二醛(MDA)
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 122次
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内容摘要

低温寒害是限制农作物区域分布的一种非生物胁迫因素,同时严重影响着农作物的产量,因此提高农作物的抗冻耐寒性具有重要的意义。随着对植物抗冻分子机制研究的不断深入,植物抗冻基因工程研究获得了显著的进展。只有避免植物自身胞内外结冰,才能降低冰冻对植物体的危害。抗冻蛋白能够在不影响体液熔点的情况下非依数地(non-colligative)降低冰点,因而能够保护多种有机体免受结冰引起的伤害。本研究以新疆农科院经济作物所的试验棉花品种(新陆早17和实验品种4084)为转基因材料,将昆虫抗冻蛋白基因Mpafp149插入植物表达载体pCAMBIA1302和pBI121中,并通过花粉管导入法转基因。收种后室内育苗培养,并进行转基因阳性植株筛选和生理生化检测,结果表明PCR阳性植株抗寒表型好于野生型植株,且在2℃低温培养3d后,丙二醛和电导率的含量明显低于野生型植株。本研究表明抗冻蛋白基因能够提高经济作物棉花的耐寒性。从棉花叶片中获得高质量和足够产量的基因组DNA,是进行棉花转基因等分子生物学研究的基础。本研究用三种方法提取棉花基因组,改良的SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)法、改良的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)法和Michaels法,对棉花基因组进行了提取并做了系统的比较,同时从琼脂糖电泳、紫外分光光度计检测及特定基因PCR效果比较了棉花新叶与老叶提取基因组的质量及各种不同处理下提取基因组DNA的效果。结果表明:Michaels法所提基因组效果要优于改良的SDS法和CTAB法。棉花新叶基因组的质量要高于老叶。不同处理温度下,4℃、-20℃和-50℃保存的叶片,其基因组DNA易降解,表明保存温度对叶片DNA的保存效果影响较大。小号塑料袋敞口保存的叶片所提取的基因组质量和产量要明显高于传统保存方式。

全文目录

中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
英文缩略语  10-11
第一部分文献综述  11-25
  第一章转基因植物的研究展  11-25
    一转抗冻蛋白基因提高植物耐寒性研究  11-16
      1 转抗冻蛋白基因植物的研究现状  12-15
        1.1 转鱼类抗冻蛋白基因植物的研究  12
        1.2 转昆虫抗冻蛋白基因植物的研究  12
        1.3 转植物抗冻蛋白基因植物的研究  12-15
      2 植物基因工程中所存在的问题及前景展望  15-16
    二转基因棉花的研究  16-19
      1. 转基因棉花研究现状  16-18
      2. 转基因棉花研究中存在的问题  18-19
    参考文献  19-25
第二部分研究正文  25-59
  第二章棉花基因组DNA 提取方法和叶片样品保存方法的优化  25-35
    1 材料和方法  25-27
      1.1 材料  25
      1.2 方法  25-27
        1.2.1 用三种方法提取棉花叶片基因组DNA  25-27
        1.2.2 同一叶片在不同保存温度下基因组的提取  27
        1.2.3 不同处理条件下叶片基因组的提取  27
    2 结果与分析  27-33
      2.1 用三种方法提取基因组DNA 及抗冻基因Mpafp149 的PCR 检测  27-28
        A: 三种方法提取基因组DNA 的电泳检测  28
        B:三种方法提取基因组 DNA 的 PCR 检测  28
      2.2 同一叶片在不同保存温度下基因组的提取及PCR 检测  28-31
      2.3 不同处理方法下叶片基因组的提取  31
      2.4 以上2.1-2.3 各组基因组DNA 的紫外分光光度计检测  31-33
    3 讨论与分析  33-34
    参考文献  34-35
  第三章昆虫抗冻蛋白基因提高棉花的耐寒性研究  35-59
    1 材料和方法  35-41
      1.1 材料  35
      1.2 方法  35-41
        1.2.1 转基因棉籽的获得  35
        1.2.2 棉花种子的萌发  35-36
        1.2.3 棉苗幼期移栽  36-37
        1.2.4 转抗冻蛋白基因棉花苗期潮霉素和卡那霉素筛选  37
          1.2.4.1 潮霉素抗性筛选  37
          1.2.4.2 卡那素抗性筛选  37
        1.2.5 卡那筛选阳性植株基因组DNA 的提取及PCR 检测  37-38
        1.2.6 RT-PCR 检测  38
        1.2.7 转抗冻蛋白基因棉花的抗寒性试验  38-39
          1.2.7.1 电导率的测定  38-39
          1.2.7.2 丙二醛含量测定  39
        1.2.8 Westernblot 检测  39-41
          1.2.8.1 野生型和转基因棉花叶片的质外体蛋白提取  39
          1.2.8.2 Westernblot 检测  39-41
    2 结果与分析  41-55
      2.1 转基因棉籽的获得  41
      2.2 棉花的出苗  41-42
      2.3 棉苗幼期移栽后长势的观察与记录  42-43
      2.4 抗冻蛋白转基因棉花苗期潮霉素和卡那霉素筛选  43-55
        2.4.1 潮霉素抗性筛选  43-46
        2.4.2 卡那素抗性筛选  46-55
    3. 结论  55
    参考文献  55-59
小结与展望  59-60
致谢  60-61
个人简历  61

转基因棉花基因组DNA的提取及抗冻蛋白基因Mpafp149的检测

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