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红菜苔春化作用相关基因及其天然早花突变的分子机理研究

作　者: 李勇
导　师: 陈国平
学　校: 重庆大学
专　业: 微生物学
关键词: 红菜苔白菜天然早花突变体 FLOWERING LOCUS C (FLC) 春化作用
分类号: S634.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

红菜苔在我国南方具有广泛的种植面积、已有近千年的栽培历史。与其它属于冬性一年生蔬菜作物的芸苔属植物（如,白菜、甘蓝等）不同,红菜苔不需要春化就可以较早的开花。红菜苔与白菜具有很多相似的生理、遗传特性,是白菜的一个变种。但与白菜相比,红菜苔对春化需求却表现出巨大的差异。本课题的研究是以天然早花突变体生理、分子生物学特性为基础,重点对控制植物开花的关键基因FLC进行研究。FLC是一个MADS-box转录因子,受春化作用的抑制,通过抑制下游开花相关基因的表达抑制植物开花。FLC低水平表达与功能的缺失是导致拟南芥、白菜等春化需要植物早花的主要原因。我们以红菜苔为研究材料,对红菜苔早花突变的分子机理进行了深入的研究,并对一些春化作用相关基因做了相关研究。主要研究结果如下:（1）在红菜苔中克隆出BrpFLC1的两种不同的剪切产物,分别命名为BrpFLC1-1和BrpFLC1-2是。在BrpFLC1-1中,第六个内含子没有被完全剪切掉,导致BrpFLC1-1编码的氨基酸提前终止。在BrpFLC1-2中,由于第六个外显子被剪切掉,导致BrpFLC1-2编码的氨基酸缺失14个氨基酸。推测这两种剪切产物编码的氨基酸都是没有功能的。（2）从红菜苔中克隆了另外的两个FLC的同源基因,分别命名为BrpFLC2和BrpFLC3,分别包含一个591 bp和618 bp的开放阅读框。BrpFLC2、BrpFLC3的编码区分别编码196、197个氨基酸残基,分子量分别21.91和21.67kD,等电点分别为8.84和9.08。BrpFLC2、BrpFLC3与拟南芥中的AtFLC（NP₁96576）分别具有84%, 82%的同源性。从红菜苔中克隆的FLC基因与大白菜中的FLC具有很高的同源性。红菜苔FLC与大白菜的FLC基因相比,只有几个核苷酸的差异。（3）对BrpFLC2和BrpFLC3基因核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列进行生物信息学预测发现, BrpFLC2、BrpFLC3编码的蛋白具有MADS-box转录因子的结构特性,均有多个最有可能被磷酸化的位点,没有发现可能的O-糖基化位。BrpFLC2、BrpFLC3基因编码的蛋白与拟南芥和大白菜FLC类似都具有跨膜结构,二级结构预测显示BrpFLC具有典型的MADS-box蛋白的二级结构, BrpFLC2、BrpFLC3主要定位于细胞核内作为转录因子参与基因的表达调控。（4） BrpFLC基因的表达模式研究,BrpFLC1、BrpFLC2在红菜苔根、茎、叶、子叶中都有较高水平的表达。BrpFLC3在茎、叶、子叶具有较高水平的表达,在根中的表达较低。BrpFLC1、BrpFLC2、BrpFLC3的表达都受春化作用的抑制,15天的春化处理可以使BrpFLC表达都降到了很低的水平。春化处理之后,红菜苔中春化作用相关基因BrpSOC1和BrpVIN3的表达量升高,BrpFRI没有明显的变化。（5）对红菜苔开花时间的研究表明,红菜苔是天然早花突变体,比白菜具有较早的开花时间。红菜苔的成花转变不需要春化处理,但是红菜苔具有一定的春化响应,春化处理可以缩短其开花时间。（6） BrpFLC1剪切方式的改变是红菜苔早花的主要原因。与晚花型白菜相比,BrpFLC1剪切的两种没有功能的转录产物。推测这BrpFLC1剪切出无功能的BrpFLC1是红菜苔早花的主要原因。推测FLC1第六个内含子的第一个碱基G到A改变,可能导致FLC1的剪切紊乱,从而导致红菜苔早花。（7）对BrpFLC的启动子和内含子I的研究表明,BrpFLC2启动子与白菜BrFLC2启动子具有类似的长度,序列同源性很高。对BrpFLC2启动子进行生物信息学软件分析表明,BrpFLC2启动子包含了多个TATA-box, CAAT-box,以及其他顺式作用元件。BrpFLC1和BrpFLC2的内含子I分别与白菜BrFLC1和BrFLC2的内含子I具有类似的长度,序列同源性很高。没有发现BrpFLC基因的这些区域与红菜苔天然早花突变的原因有关。从红菜苔中克隆了FLC上游基因FRI的同源基因BrpFRI的起始密码子附近的一段区域,这一在拟南芥中经常发生突变导致早花的区域,在红菜苔中没有发生导致功能丧失的突变。（8）分析FLC在红菜苔和白菜中的表达模式发现,在红菜苔中BrpFLC具有较低水平的表达。红菜苔的早花突变与BrpFLC较低水平的表达具有一定的关系。（9）从红菜苔中克隆了VIN3的同源基因BrpVIN3的一段包括VIN3的PHD和FNIII区序列,并根据siRNA序列设计要求,构建了BrpVIN3基因的RNAi载体。为生产转基因蔬菜和研究芸苔属植物中VIN3的功能打下了基础。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
1 绪论  12-23
  1.1 多种途径影响植物的成花转变  12-13
  1.2 春化作用相关基因FLC 的表达调控  13-17
    1.2.1 自主途径（Autonomous Pathway）  14
    1.2.2 PAF1 复合体（PAF1complex)  14-15
    1.2.3 SWR1 复合体（SWR1 complex）  15
    1.2.4 FRI 依赖途径(FRI complex)  15-16
    1.2.5 春化作用途径(Vernalization pathway )  16-17
    1.2.6 影响FLC 表达的其它基因  17
  1.3 拟南芥中的天然早花突变体  17-19
  1.4 芸苔属中FLC 及天然早花突变体的研究进展  19-20
  1.5 研究的目的与内容  20-23
    1.5.1 研究的目的、意义  20-21
    1.5.2 本文研究的主要内容  21-22
    1.5.3 本文的特色与创新之处  22-23
2 材料与方法  23-41
  2.1 材料  23-26
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 质粒载体与菌株  23
    2.1.3 主要仪器设备  23-24
    2.1.4 主要分子生物学试剂和试剂盒  24
    2.1.5 各种试剂及培养基的配制  24-26
  2.2 实验方法  26-29
    2.2.1 种植、样品处理及采集  26-27
    2.2.2 红菜苔和白菜总RNA 提取  27
    2.2.3 红菜苔基因组DNA 提取  27-28
    2.2.4 JM109 感受态细胞的制备—CaC12 法  28
    2.2.5 小量碱裂解法提取质粒DNA  28-29
    2.2.6 核酸的电泳及纯度、浓度测定  29
  2.3 BrpFLC 基因cDNA 及其它春化作用相关基因的克隆  29-32
    2.3.1 引物设计  29-30
    2.3.2 RNA 的提取  30
    2.3.3 反转录（RT）  30
    2.3.4 PCR 扩增  30
    2.3.5 PCR 产物的回收和纯化  30-31
    2.3.6 PCR 产物的转化  31
    2.3.7 阳性转化子的鉴定  31-32
    2.3.8 红菜苔BrpFLC 及其它春化作用相关基因序列的分析  32
  2.4 BrpFLC 启动子及其内含子I 的克隆  32-34
    2.4.1 引物设计  32-33
    2.4.2 DNA 的提取  33
    2.4.3 BrpFLC1 和BrpFLC2 内含子I、BrpFLC2 启动子的克隆、测序及分析  33
    2.4.4 BrpFRI 的克隆、测序及分析  33-34
  2.5 红菜苔BrpFLC 及其它春化作用相关基因表达模式的研究  34-36
    2.5.1 Northern 探针的制备  34
    2.5.2 Northern 杂交  34-35
    2.5.3 半定量RT-PCR  35-36
  2.6 RNAi 沉默载体的构建  36-41
3 结果与分析  41-73
  3.1 BrpFLC 基因cDNA 的克隆及其序列分析  41-54
    3.1.1 BrpFLC1 基因cDNA 的克隆及序列分析  41-45
    3.1.2 BrpFLC2 和BrpFLC3 基因cDNA 的克隆和序列分析  45-48
    3.1.3 BrpFLC2 和BrpFLC3 基因cDNA 编码氨基酸序列分析  48-53
    3.1.4 小结  53-54
  3.2 BrpFLC 的表达模式的研究  54-57
    3.2.1 BrpFLC 在红菜苔不同组织中的表达  54-55
    3.2.2 春化作用抑制BrpFLC 的表达  55
    3.2.3 红菜苔中春化作用相关基因的克隆及其与春化作用的关系  55-56
    3.2.4 小结  56-57
  3.3 红菜苔天然早花突变分子机理的研究  57-67
    3.3.1 红菜苔开花时间研究  57-58
    3.3.2 BrpFLC1 在红菜苔中的剪切紊乱是红菜苔早花突变的主要原因  58-61
    3.3.3 植物开花关键基因FLC 在红菜苔和白菜中的表达差异  61-62
    3.3.4 BrpFLC 启动子区及内含子I 的扩增  62-65
    3.3.5 从红菜苔中克隆BrpFRI 的部分序列  65-67
    3.3.6 小结  67
  3.4 红菜苔春化作用关键基因BrpVIN3 片段的克隆及其RNAi 载体的构建  67-73
    3.4.1 红菜苔春化作用关键基因BrpVIN3 片段的克隆  68-69
    3.4.2 红菜苔春化作用关键基因BrpVIN3 RNAi 载体的构建  69-71
    3.4.3 小结  71-73
4 结论与展望  73-76
  4.1 主要结论  73-74
  4.2 后续研究工作的建议及展望  74-76
致谢  76-77
参考文献  77-83
附录  83-85
  A. pBIN19-VIN3 测序结果  83-84
  B. 红菜苔 FLC1 第五到第七个外显子之间 DNA 序列测序结果  84-85
  C. 在攻读学位期间发表的论文目录  85

红菜苔春化作用相关基因及其天然早花突变的分子机理研究

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