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甘露糖筛选系统在番茄转化中的应用

作　者: 王洪伟
导　师: 王兴智
学　校: 东北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: PMI 酸性成纤维生长因子单链抗体转基因番茄
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 74次
引　用: 2次
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内容摘要

在植物转化系统中应用较为广泛的标记基因包括抗生素抗性基因和除草剂抗性基因两大类,常用的抗性基因包括nptⅡ、hpt和bar基因等。但是利用这些标记基因的选择体系都可能存在生物安全性问题,因而培育无标记基因及安全标记基因的转基因植物已成为基因工程的重要目标之一。甘露糖选择体系是一种正选择体系,磷酸甘露糖异构酶（PMI）是一种安全的标记基因。为了获得对肿瘤治疗具有积极作用的aFGF的单链抗体,本实验以大肠杆菌manA基因作为选择标记基因,利用甘露糖为选择剂来获得能够表达aFGF单链抗体的转基因番茄。我们首先通过七组对照实验确定甘露糖作为选择剂的最佳浓度,然后分别构建了植物表达载体pM390-scFv和pM390-E₈-scFv（E₈启动子为果实特异性启动子）,构建的双元表达载体带有一个单链抗体基因,载体上的大肠杆菌manA基因可以表达磷酸甘露糖异构酶,因而在转化过程中可以使用甘露糖作为选择剂。通过实验我们初步建立了PMI/甘露糖正选择体系,切取7～9d苗龄的番茄子叶作为外植体预培养2天,以携带植物表达载体的农杆菌LBA4404侵染外植体5～10 min,培养基中添加2 mg/l玉米素（ZT）和0.1 mg/l吲哚乙酸（IAA）,每升选择培养基中添加甘露糖15 g及蔗糖15 g时再生植株会获得较高的转化率。我们利用该体系成功的获得了54株再生番茄植株,并且通过PCR初步证明获得了阳性转scFv植株。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
目录  6-8
1 引言  8-17
  1.1 无选择标记基因及安全选择标记基因转基因植物研究进展  8-13
    1.1.1 无选择标记基因的转化系统  8-11
    1.1.2 利用安全标记基因的转化系统  11-12
    1.1.3 PMI/甘露糖正选择体系  12
    1.1.4 PMI/甘露糖转化系统的安全性评价  12-13
  1.2 人类酸性成纤维生长因子介绍  13
  1.3 单链抗体的临床应用  13-14
  1.4 植物生物反应器  14-16
    1.4.1 植物生物反应器的特点  14
    1.4.2 几种常用的生产重组蛋白质的植物表达系统  14-16
  1.5 植物来源抗体的应用前景  16-17
2 材料与方法  17-26
  2.1 材料  17-18
    2.1.1 植物材料  17
    2.1.2 质粒和菌种  17
    2.1.3 化学试剂  17
    2.1.4 PCR引物  17
    2.1.5 培养基  17-18
  2.2 实验方法  18-26
    2.2.1 甘露糖作为选择剂的最佳浓度  18
    2.2.2 植物表达载体的构建  18-23
    2.2.3 农杆菌介导的番茄转化  23-24
    2.2.4 植物基因组DNA的分离  24-25
    2.2.5 再生植株的PCR检测  25-26
3 结果  26-31
  3.1 甘露糖作为选择剂的最佳浓度  26-27
    3.1.1 不同浓度的甘露糖对外植体再生的抑制作用  26
    3.1.2 番茄外植体在含有不同浓度甘露糖培养基中的生长状态  26-27
  3.2 植物表达载体的构建  27-29
    3.2.1 构建植物表达载体pM390-scFv  27
    3.2.2 构建植物表达载体pM390-E_8-scFv  27-28
    3.2.3 重组质粒pM390-scFv的鉴定  28
    3.2.4 重组质粒pM390-E_8-scFv的鉴定  28-29
  3.3 农杆菌介导的番茄转化  29-30
  3.4 转基因植株的PCR检测  30-31
4 讨论  31-33
  4.1 甘露糖正选择体系的优化  31
  4.2 农杆菌介导的番茄遗传转化体系的优化  31-32
  4.3 番茄作为生物反应器的表达宿主  32-33
5 结论  33-34
参考文献  34-37
致谢  37

甘露糖筛选系统在番茄转化中的应用

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