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荷人卵巢癌裸鼠循环无细胞DNA的来源及其与瘤负荷、凋亡的关系

作　者: 崔洪银
导　师: 吴小华
学　校: 河北医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 卵巢上皮性癌荷人卵巢癌裸鼠循环无细胞DNA 循环无细胞CA125-DNA 半定量PCR
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:循环无细胞DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)是存在于体液中的碎裂的核酸片段。本实验利用人卵巢癌细胞株SKOV3建立荷人卵巢癌裸鼠移植模型。采用半定量PCR的方法,检测荷人卵巢癌裸鼠血清和腹水中无细胞DNA的含量,并与肿瘤的重量、凋亡率进行对比,研究人卵巢癌移植瘤裸鼠模型血清及腹水中cfDNA的血流动力学改变,探讨cfDNA在卵巢上皮性癌临床诊断及病情监测中的意义。通过检测荷瘤裸鼠经化疗前后血清cfDNA水平的变化规律,并与细胞凋亡进行对比,从而为cfDNA是否可作为无创性的卵巢癌患者病情监测及疗效观察的生物学指标提供理论依据。方法:将人卵巢癌细胞株SKOV3种植于6-8周龄雌性裸鼠的皮下及腹腔中,观察裸鼠成瘤和肿瘤生长情况。分别于14天(荷瘤1组),21天(荷瘤2组)和30天(荷瘤3组)取皮下种植瘤模型血清及肿瘤,14天取腹水种植瘤模型血清和腹水。皮下种植瘤模型化疗组在种植后第30天用顺铂3mg/kg化疗1次,于化疗后第1天(化疗1组),第3天(化疗2组)和第10天(化疗3组)取血清及肿瘤。用QIAGEN微量提取试剂盒提取血清及腹水中游离的DNA片段。我们针对临床常用的诊断和监测指标血清CA125蛋白的基因序列设计了扩增产物为101bp、261bp、189bp和336bp大小的四组DNA片段引物。用半定量PCR方法扩增β-actin, CA125-DNA片段和ALU重复片段。肿瘤相关cfDNA的量用ALU247/ALU115来表示,CA125-cfDNA的相对水平用CA125 DNA/β-actin来表示。检测荷瘤1、2、3组;化疗1、2、3组和腹水组的血清及腹水组腹水中cfDNA的含量,并与相应的肿瘤重量进行对比。用TUNNEL法检测荷瘤3组及化疗1、2、3组组织细胞的原位凋亡,将其凋亡率与相应的cfDNA含量进行相关性分析。试验结果采用SPSS13.0统计软件进行独立样本t检验,单因素方差分析,和spearman相关分析进行统计学处理。结果:1各组基因片段在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清及腹水中的表达情况在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的血清及腹水中均能检测到人类特有的基因片段β-actin、ALU115、ALU247以及CA125-cfDNA中的101bp片段。其中78例卵巢癌血清标本中,有41例能检测到CA125-cfDNA的261bp基因片段,189bp片段含量很少,336bp未能检测,三个指标相应的β-actin均能检测出来。故本实验所作数据分析中的CA125-cfDNA仅就101bp片段进行比较和讨论。3AO组(种植3AO细胞株后30天取材)与SKOV3瘤负荷3组(种瘤时间相同)血清中的肿瘤相关cfDNA的含量没有显著性差异(t=0.193,P>0.05),CA125-cfDNA的含量没有显著性差异(t=-1.423,P>0.05)。腹水组荷瘤裸鼠腹水中的肿瘤相关cfDNA的含量与血清中的含量相比没有显著性差异(t=1.412,P>0.05),腹水中的CA125-cfDNA的含量与血清中的含量没有显著性差异(t=3.535,P>0.05)。(Table 1)。2各组人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中cfDNA水平的变化情况及其与瘤负荷的关系分别于皮下种植SKOV3卵巢癌细胞株后14天(荷瘤1组),21天(荷瘤2组)和30天(荷瘤3组)取人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中的CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA,结果发现血清中的CA125-cfDNA的表达各组间有差异(F=15.191,P<0.05),荷瘤2组高于荷瘤1组,差异有显著性(P<0.05),荷瘤3组高于荷瘤2组,差异有显著性(P<0.05)。血清中的肿瘤相关cfDNA的表达各组间有差异(F=52.253,P<0.05),荷瘤2组高于荷瘤1组,差异有显著性(P<0.05),荷瘤3组高于荷瘤2组,差异有显著性(P<0.05)。(Table 1)。SKOV3瘤负荷1、2、3组裸鼠血清中的CA125-cfDNA 101bp片段及肿瘤相关cfDNA与肿瘤重量呈正相关(CA125-cfDNA 101bp片段的R=0.830, P<0.05肿瘤相关cfDNA的R=0.780, P<0.05)。(Table3,Fig8,Fig9)。3血清cfDNA在化疗前后的变化情况化疗组荷瘤裸鼠血清CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA的值在化疗后第1天达最高水平,第3天有下降趋势,但没有统计学意义,(CA125-cfDNA的P=0.932,肿瘤相关cfDNA的P=0.068,均>0.05)。在化疗第10天其值明显低于化疗前水平,差异有显著性(CA125-cfDNA的P=0.047,肿瘤相关cfDNA的P=0.013,均<0.05)。(Table3)。4化疗前后血清cfDNA水平与肿瘤细胞凋亡的关系化疗前后血清CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA与肿瘤细胞的凋亡率呈正相关(CA125-cfDNA 101 bp片段的R=0.742,P<0.05;肿瘤相关cfDNA的R=0.693,P<0.05)。(Table2)。结论:1成瘤裸鼠血清及腹水中可以检测到人卵巢癌细胞株的人类特异性cfDNA,其含量在化疗后先显著升高而后下降,并与TUNEL检测的凋亡率呈正相关,由此可以证实cfDNA来源于肿瘤细胞,并与其凋亡和坏死有关。2血清CA125-cfDNA中101 bp片段及肿瘤相关cfDNA的含量与瘤负荷呈正相关,有可能为卵巢上皮性癌的诊断及病情监测提供理论依据。

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