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不同物种保守性miRNA的克隆与功能探索

作　者: 宋响文
导　师: 王莹
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: miRNA 动植物保守性生物信息学半定量PCR 地高辛杂交
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的：通过实验克隆,从具有经济价值的脊椎动物(青蛙、蟾蜍、家鸡、罗非鱼)中获得新miRNA,选择材料为不同进化阶段的物种,寻找物种间具有保守性的新miRNA,并与miRNAbase里miRNA进行比对和保守性分析,根据与已知功能miRNA保守性分析和生物信息学分析,进一步进行功能预测与验证。方法：1.直接克隆法获得miRNA序列；2. RT-PCR方法和地高辛杂交法实验确定新miRNA;3.生物信息学预测保守性miRNA以及实验验证；4.半定量PCR检测miRNA的表达差异。结果：通过克隆成功获得了4条保守性的序列,并与已经收集在库的miRNA319同样具有很高的同源性,运用了生物信息学方法在鱼中预测与这4条序列具有保守性miRNA,并在鲤鱼得到实验的验证。同时利用半定量PCR检测了从青蛙中获得miRNA,在寒冷的诱导状态和室温下,出现了表达差异。结论：本研究尝试直接将RNA加到尼龙膜上,然后直接杂交,省出电泳和转膜步骤,传统的转膜效率存在不稳定,对于实验室不具备先进的转膜设备,是一种不错的选择。克隆得到的具有保守性的miRNAs,为动植物之间miRNAs存在保守性提供了新的证据；通过半定量PCR检测青蛙中这条miRNA在不同的温度状态下出现的表达差异,推测其表达与温度存在一定的联系,为动物抗寒机制研究打下基础；这些来源不同进化阶段的保守性miRNA,也为研究物种的进化规律提供一条新的思路。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-9
第一章前言  9-15
  1.1 miRNA的简介  9
  1.2 miRNA的发现  9
  1.3 miRNA的生物合成  9-10
  1.4 miRNA的作用方式  10-11
  1.5 miRNA的保守性  11-12
  1.6 研究背景与思路  12
  1.7 研究创新点  12-14
  1.8 技术路线  14-15
第二章一种关于动物肝脏RNA分离方法的改进  15-18
  2.1 实验材料青蛙肝脏  15
  2.2 实验仪器与药品  15
  2.3 实验方法  15-17
  2.4 实验结果  17-18
第三章 miRNA分子的克隆  18-41
  3.1 实验材料及仪器  18-20
    3.1.1 分子生物学实验试剂  18
    3.1.2 细菌培养用试剂  18-19
    3.1.3 菌株  19
    3.1.4 其它试剂及试剂盒  19
    3.1.5 RNA接头及引物  19-20
    3.1.6 仪器  20
    3.1.7 耗材的处理  20
    3.1.8 实验材料  20
  3.2 实验方法  20-26
    3.2.1 实验材料处理  20-21
    3.2.2 总RNA提取  21
    3.2.3 小RNA分离  21
    3.2.4 小RNA分子加Poly(A)尾  21-22
    3.2.5 小分子RNA 5'接头连接  22
    3.2.6 cDNA的合成  22
    3.2.7 PCR扩增反应  22
    3.2.8 电泳及目的条带回收  22-23
    3.2.9 连接反应  23
    3.2.10 制备感受态细胞  23-24
    3.2.11 转化及克隆  24
    3.2.12 菌落PCR  24
    3.2.13 序列测定  24
    3.2.14 生物信息学分析  24-25
    3.2.15 探针标记  25
    3.2.16 转膜和RNA的固定  25
    3.2.18 杂交  25-26
    3.2.19 NBT/BCIP化学显色法  26
  3.3 实验结果  26-36
    3.3.1 总RNA浓度测定及完整性检测  27-28
    3.3.2 小RNA的富集  28
    3.3.3 PCR电泳图  28-29
    3.3.4 菌落PCR鉴定结果  29
    3.3.5 测序结果及序列分析  29-33
    3.3.6 Dig-northern blot  33-35
    3.3.7 RT-PCR检测小RNA在4种动物中的表达  35
    3.3.8 克隆得到的序列与miRNA319家族的同源性比较  35-36
  3.4 已知保守的miRNA在鱼基因组的生物学信息学预测以及实验验证  36-40
    3.4.1 在NCBI比对的结果以及二级结构预测  37-39
    3.4.2 RT-PCR检测验证  39-40
  3.5 讨论  40-41
第四章所得miRNA分子表达分析及功能预测  41-48
  4.1 实验材料及仪器  41-43
    4.1.1 实验试剂  41-42
    4.1.2 其它试剂及试剂盒  42
    4.1.3 引物  42
    4.1.4 仪器  42
    4.1.5 耗材的处理  42
    4.1.6 实验材料处理  42-43
  4.2 实验方法  43-44
    4.2.1 总RNA的提取  43
    4.2.2 总RNA分子加Poly(A)尾  43
    4.2.3 cDNA合成  43-44
    4.2.4 检测miRNA在动物不同状态中的表达  44
  4.3 实验结果  44-47
    4.3.1 总RNA浓度及完整性检测  45
    4.3.2 检测miRNA在动物中的表达  45-47
  4.4 讨论  47-48
第五章小结与展望  48-50
  5.1. 小结  48
  5.2. 展望  48-50
参考文献  50-53
附录  53-59
致谢  59-60
发表论文  60

不同物种保守性miRNA的克隆与功能探索

内容摘要

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