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沙地云杉胚性细胞悬浮培养研究

作　者: 郭小兵
导　师: 白玉娥
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 沙地云杉成熟合子胚胚性愈伤组织细胞悬浮培养动力学
分类号: S791.18
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文以沙地云杉成熟合子胚为材料,诱导胚性愈伤组织,并继代培养,进而建立分散性好、活力高的悬浮细胞系。为进行沙地云杉的原生质体培养、基因导入及细胞融合等研究提供实验基础。1沙地云杉成熟合子胚诱导的愈伤组织类型有胚性与非胚性愈伤两种。质地松软,表面有光泽的愈伤为胚性愈伤,其余为非胚性愈伤。愈伤组织的诱导率比较高,大部分诱导率在60%以上,但没有添加激素的培养基上不产生愈伤。在2mg/L6-BA和1mg/L2,4-D的浓度配比下,达到最高诱导率,为93.75%。所有胚性愈伤组织在保持和增殖时出现了褐化现象,但是程度不一样:在不加任何激素时,愈伤组织褐化率为100%;在激素配比1mg/L6-BA和0.2mg/L2,4-D时愈伤组织褐化率最小,为16.67%;总体而言2,4-D浓度在0.1mg/L和0.2mg/L时愈伤组织褐化率小,6-BA和2,4-D一起附加时比单个附加时的愈伤组织褐化率小。同样,2,4-D浓度在0.1mg/L和0.2mg/L时愈伤组织胚性保持的好,6-BA和2,4-D一起附加时比单个附加时的愈伤组织胚性保持的好。2沙地云杉胚性细胞悬浮培养生长周期为12d,通过选择,最佳培养条件是:DCR+0.1mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖,pH6.0,接种量3.0%,摇床转速为110r/min,25±1℃、黑暗条件下震荡培养。3动力学研究过程中,细胞鲜重和干重的变化趋势是一致的,延迟期为第0～3d;对数生长期为4～8d;从第9d开始进入稳定期。细胞活力的OD值第4d时达到最大,为0.74;随后开始下降,到第10d时降到最小,为0.34;之后又有所回升。由细胞活力和干重变化曲线得出,继代周期为6～8d。在生长周期内,pH值一直在减小,第1～9d减小幅度比10～12d间要大。NH⁴⁺在培养过程中消耗最快,在第10d时已耗尽;总糖的消耗量在3～8d下降最快,NO₃^-和PO₄^3-的消耗趋势与蔗糖的基本相同,只是总糖的消耗前期与后期比NO₃^-和PO₄^3-的消耗要快。NO₃^-的减少率为63.79%,NH⁴⁺为100%,蔗糖和PO₄^3-分别为80%和84.62%。由于缺少铵盐,细胞生长从第9d开始进入稳定期。4细胞活力与其它各参数之间在0.05和0.01检验水平下都不相关;而其余的各参数之间在0.01检验水平下都显著相关。细胞干重与其余的各参数之间的都呈负相关。除了细胞活力OD值外,其余个参数与细胞干重的相关系数都在-0.95以上。因此,培养液中不仅是总糖和其它营养元素直接影响细胞的增殖,培养液酸碱性也直接影响细胞的增殖。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 前言  9-18
  1.1 植物细胞悬浮培养技术研究进展及意义  9-10
  1.2 针叶树种胚性愈伤诱导与保持影响因素  10-12
    1.2.1 外植体  10-11
    1.2.2 基因型  11
    1.2.3 植物激素  11-12
    1.2.4 其它因素  12
  1.3 林木树种悬浮系建立过程中的影响因素  12-16
    1.3.1 培养材料  12-13
    1.3.2 培养基成分  13-15
    1.3.3 培养条件和培养方式  15-16
  1.4 悬浮培养的动力学及各参数间的相关性研究  16-17
  1.5 试验的目的意义及内容  17-18
2 材料与方法  18-25
  2.1 试验材料  18-19
    2.1.1 材料来源  18
    2.1.2 外植体处理  18
    2.1.3 沙地云杉愈伤组织的诱导及保持和增殖  18
      2.1.3.1 胚性愈伤组织诱导  18
      2.1.3.2 胚性愈伤组织保持与增殖  18
    2.1.4 仪器和试剂  18-19
  2.2 试验方法  19-25
    2.2.1 悬浮培养系的建立与培养条件的选择优化  19-20
    2.2.2 参数的测定  20-24
    2.2.3 试验数据统计分析  24-25
3 结果与分析  25-35
  3.1 沙地云杉胚性愈伤组织的诱导和增殖  25-28
    3.1.1 沙地云杉胚性愈伤组织诱导  25-26
    3.1.2 沙地云杉胚性愈伤组织保持  26-28
  3.2 沙地云杉胚性细胞悬浮培养系的建立与优化  28-31
    3.2.1 生长周期测定  28
    3.2.2 基本培养基选择  28-29
    3.3.3 pH，碳源，转速及接种量对悬浮培养的影响  29-30
    3.3.4 最佳激素浓度配比选择  30-31
  3.3 沙地云杉胚性细胞悬浮培养过程动力学分析  31-34
    3.3.1 细胞鲜重和干重生长曲线  31-32
    3.3.2 细胞活力变化规律  32-33
    3.3.3 pH 值的变化规律  33
    3.3.4 蔗糖、硝酸根、铵根、磷酸根离子的消耗  33-34
  3.4 悬浮培养过程中各参数间的相关性分析  34-35
4. 讨论  35-37
  4.1 2,4-D 和6-BA 的不同浓度组合对植物愈伤组织诱导影响  35
  4.2 2,4-D 和6-BA 的不同浓度组合对植物胚性愈伤组织胚性保持影响  35
  4.3 建立植物胚性细胞悬浮培养系的影响因素  35-36
  4.4 植物胚性细胞悬浮培养体系的动力学研究  36
  4.5 植物胚性细胞悬浮培养过程中各参数的相关性  36-37
5 结论  37-38
致谢  38-39
参考文献  39-44
作者简介  44

沙地云杉胚性细胞悬浮培养研究

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