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重组人CYP2C9，CYP2C19及其相关SNP酵母表达体系的构建和其在药物抑制筛选中的初步研究

作　者: 马平平
导　师: 崔亚丽
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CYP2C9 CYP2C19 SNP 酶动力学分析 药物高通量筛选 IC50
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


CYP2C9,CYP2C19作为细胞色素P450家族的重要组成部分，在药物代谢过程中担任重要作用，据统计大约有20％临床用药被CYP2C家族代谢，但由于二者都是多态性显著的酶，在临床用药时往往会引发一系列药物不良反应和药物相互作用，因此对其基因多态性的研究就显得颇为重要。本研究采用体外重组技术，克隆、表达了CYP2C9,CYP2C19野生株及其相应的5个SNPs（CYP2C9-R144C,CYP2C9-1359L，CYP2C19-S51G，CYP2C19-R329H，CYP2C19-R442C），建立了一个体外表达重组CYP2C9,CYP2C19酶的酵母体系，并且利用这个体系表达的多态性酶对其进行酶学分析和药物抑制高通量实验，测得Km，Vmax，Clint以及半数抑制常数IC50，从而药物相互作用的预测和新药的研究开发提供了理论依据。首先，通过定点突变PCR的方法，在野生株的cDNA上引入突变位点，并将其与酵母表达载体pYES2／CT连接，经测序验证，电转入已经整合了细胞色素P450氧化还原酶基因（POR）的酿酒酵母细胞，利用半乳糖诱导目的蛋白的表达，经western blot验证，目的蛋白在55KD处有清晰的条带出现，与预期大小相同，说明目的蛋白能够表达。随后大量诱导表达目的蛋白并使用bead beater裂解器裂解得酵母微粒体，经BSA标准曲线换算出制备的微粒体浓度后，通过CO还原示差光谱法检测，计算微粒体蛋白中P450的含量，结果如下：CYP2C9-WT 30 pmol／mg,CYP2C9-R144C 60pmol／mg,CYP2C9-1359L 8 pmol／mg，CYP2C19-WT 30pmol／mg，CYP2C19-R329H 53pmol／mg，CYP2C19-R442C 27pmol／mg，CYP2C19-S51G未能计算出含量。其次，通过FDA公布的方法，使用探针底物通过HPLC验证体系的可行性，得到的Km值与FDA公布的数值比较，结果符合FDA的要求，并且与其他文献报道的使用相同体系获得的数据接近；另外，对制备的酵母微粒体的各项指标进行了考察，以保证实验的准确度，包括制备的酶活性与人肝微粒体的比较，制备的酶的稳定性研究，结果发现制备的酶稳定性可以满足实验所需，在冰浴中可以保存6小时，且反复冻融不影响其活性，但经过与人肝微粒体活性比较，发现其活性略低，但结果在本实验能够接受的范围之内，也证明了酵母表达体系的可靠性以及所得数据的真实性。第三，利用制备的酵母微粒体，进行相应的酶学分析。1．分别使用探针底物与荧光底物对位点突变引起的酶活性变化进行检测，（CYP2C9探针底物双氯氛酸，荧光底物BOMCC；CYP2C19探针底物S-美芬妥英，荧光底物CEC）结果显示，各位点的突变都不同程度的降低了CYP酶的活性，且CYP2C9-1359L和CYP2C19-R442C突变针对荧光底物和探针底物降低的程度不等。2．同样使用探针底物和荧光底物对制备的酵母微粒体进行酶动力学研究，检测各个突变株的Km，Vmax以及Clint，结果显示：不论针对探针底物还是荧光底物，各个突变株的Km均增大，Clint均下降，而Vmax变化差异较大。在探针底物实验中，与CYP2C9野生型相比，其突变株R144C和，1359L的Km分别增加了大约一倍和三倍，Clint分别为变化不大和下降了75％左右；与CYP2C19野生型相比，其突变株R329H，R442C的Km分别增加了三倍和略有增加，Clint分别下降了80％和95％，在荧光底物实验中，CYP2C9-R144C的Km比野生型增加了一倍，Clint下降了25％左右，CYP2C19-S51G，R329H，R442C与野生型相比，Km都增大了一倍左右，Clint分别下降了30％，60％和30％。3．利用荧光底物对8类22种药物进行高通量抑制实验，底物选取Km附近的浓度，药物作为抑制剂稀释成一系列的浓度，利用荧光检测技术测定抑制剂的半数抑制常数IC50，其中也包括CYP2C9和CYP2C19已知的特异性抑制剂，结果表明：CYP2C9特异性抑制剂磺胺苯比唑的IC50为0．7，CYP2C19特异性抑制剂反苯环并胺IC50值为7．1，均与FDA公布的数值接近，也说明了该方法的可行性。其他抑制剂对制备的微粒体的抑制程度各不相同，化学结构或治疗作用类似的同类药品对CYP2C9,CYP2C19的抑制情况不一；不同基因型被同一种药物抑制程度也不尽相同，甚至差别较大。总之，本实验成功建立了重组人CYP2C9,CYP2C19及其相应SNP的酵母表达系统，初步建立了对CYP2C9，CYP2C19多态性重组酶进行酶动力学检测和药物抑制作用的体外检测技术体系。并且利用这个体系对单核苷酸位点突变引起的药物不良反应和药物相互作用进行了初步研究，所得数据可以对临床合理用药提供理论指导，最大程度的避免药物不良反应和相互作用的发生，并且为新药的开发与研究提供了相应的理论支持。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-11
前言  11-14
第一章 文献综述  14-34
  1.1 细胞色素P450及其与药物代谢关系的研究进展  14-23
    1.1.1 CYP的命名与分布  14
    1.1.2 CYP酶的氧化活性单体  14-15
    1.1.3 CYP酶系反应机制  15-17
    1.1.4 CYP酶的多样性  17-19
    1.1.5 CYP酶在药物代谢中的作用  19
    1.1.6 CYP酶与药物相互作用的关系  19-21
    1.1.7 与CYP有关的药物代谢研究方法进展  21-22
    1.1.8 研究药物对CYP作用关系的意义  22-23
  1.2 2C9基因多态性研究进展  23-28
    1.2.1 CYP2C9基因多态性的分子机制  23-26
    1.2.2 CYP2C9基因多态性检测  26-27
    1.2.3 影响CYP2C9活性的因素  27
    1.2.4 CYP2C9基因多态性与药物代谢的关系  27-28
    1.2.5 展望  28
  1.3.2C19基因多态性研究进展  28-33
    1.3.1 CYP2C19基因多态性的分子机制  28-30
    1.3.2 CYP2C19基因多态性检测  30-31
    1.3.3 影响CYP2C19活性的因素  31-32
    1.3.4 CYP2C19基因多态性与药物代谢的关系  32
    1.3.5 展望  32-33
  1.4.论文研究目的与立题意义  33-34
第二章 CYP2C9,CYP2C19及其相关SNP在酿酒酵母中的表达、鉴定  34-49
  2.1 材料  34-37
    2.1.1 菌株和质粒  34-35
    2.1.2 试剂  35
    2.1.3 主要溶液和培养基  35-36
    2.1.4 主要仪器  36-37
  2.2 方法  37-42
    2.2.1 pYES2/CT-CYP2C9,CYP2C19重组表达载体的构建  37-39
    2.2.2 重组酵母菌株的构建  39
    2.2.3 目的蛋白的表达和鉴定  39-41
    2.2.4 酵母微粒体的制备和检测  41-42
  2.3 结果  42-46
    2.3.1 pYES2/CT-CYP2C9,CYP2C19重组表达载体的构建  42-44
    2.3.2 目的蛋白的Western Blot分析  44
    2.3.3 CYP2C9,CYP2C19微粒体的检测  44-46
  2.4 讨论  46-49
    2.4.1.表达体系的选择  46-48
    2.4.2.表达量的分析  48-49
第三章 体系进一步验证及酶的活性分析  49-54
  3.1.材料  49
    3.1.1 酵母微粒体  49
    3.1.2 主要试剂  49
    3.1.3 主要溶液  49
    3.1.4 主要仪器  49
  3.2 方法  49-50
    3.2.1 HPLC法体系验证  49-50
    3.2.2 酶活性分析  50
    3.2.3 酶稳定性分析  50
  3.3 结果  50-52
    3.3.1 HPLC法体系验证  50-51
    3.3.2 酶活性分析  51
    3.3.3 酶稳定性分析  51-52
  3.4 讨论  52-54
第四章 重组CYP2C9,CYP2C19相关SNP酶的酶学分析和药物高通量筛选  54-69
  4.1 材料  54-55
    4.1.1 酵母微粒体  54
    4.1.2 主要试剂  54
    4.1.3 主要溶液  54-55
    4.1.4 主要仪器  55
  4.2 方法  55-58
    4.2.1 酵母微粒体酶活性检测  55
    4.2.2 酶动力学分析  55-56
    4.2.3 特异性抑制剂对野生株微粒体的抑制反应  56
    4.2.4 药物高通量筛选  56-58
  4.3 结果  58-63
    4.3.1 酵母微粒体酶活性检测  58-60
    4.3.2 酶动力学分析  60-61
    4.3.3 特异性抑制剂对野生株微粒体的抑制反应  61-62
    4.3.4 药物高通量筛选  62-63
  4.4 讨论  63-69
    4.4.1 酵母微粒体酶活性检测  63-65
    4.4.2 酶动力学分析  65-66
    4.4.3 药物高通量筛选  66-69
全文小结  69-71
参考文献  71-76
攻读硕士学位期间取得的科研成果  76-77
致谢  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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