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盾壳霉产孢相关基因的克隆及液体产孢条件的优化

作　者: 吴素真
导　师: 姜道宏
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 孢子形成 PEX2 液体振荡培养 核盘菌 生物防治
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 93次
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内容摘要


核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是重要的植物病原真菌，给油菜、向日葵等作物的生产造成了巨大的经济损失。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的重寄生真菌，是作物菌核病的重要生防菌。本文对T-DNA标记插入突变产孢缺陷型菌株ZS-1T16229中相关基因进行了部分克隆及序列分析，并对ZS-1菌株在液体振荡培养下促进产孢的条件进行了探讨，结果如下：从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选出的菌丝生长、产孢缺陷型突变株ZS-1T16229，以之为材料，采用TAIL-PCR技术对T-DNA标记插入位点右侧的基因组DNA进行了克隆，获得了大小为1131bp的DNA片段；对该基因组DNA片段进行了序列分析，并利用GenScan软件进行了阅读框(ORF)预测，结果表明该DNA片段中可能含有一个不完整的阅读框(324—1100nt)，编码259aa。对推定蛋白的氨基酸序列进行了同源性比较(Blastp)，发现该蛋白含有保守的Pex2-Pex12结构域，与真菌的过氧化物酶体蛋白PEX2有极高的同源性，如与烟曲霉(Aspergillus fumigatus Af293)的PEX2相同部位等同的氨基酸为59％，类似的氨基酸达74％。命名该基因为CMPEX2，证实T-DNA标记在ZS-1T16229中为单拷贝插入，破坏CMPEX2的后半部分。PEX2参与真菌的活性氧代谢，消解活性氧的毒害作用。研究发现，与出发菌株相比，突变体ZS-1T16229偏向于培养基质中生长，推定与缓解活性氧对菌体毒害作用有关，CMPEX2基因可能与ZS-1T16229的产孢缺陷型等表型相关。探讨了在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中添加少量琼脂粉(0.1‰-1.5‰w／v)对盾壳霉ZS-1菌株的生物产量及产孢的促进作用。研究发现，在PDB添加不同量的琼脂粉对ZS-1菌株的生物产量和产孢均有显著的促进作用。命名该液体培养基为PDB-1a，其中当琼脂粉的添加量为0.75‰时，综合效果最为理想，在此条件下，于100ml PDB中培养10d ZS-1菌株的生物产量达616.1±6.2mg，孢子产量为(6.1±0.1)×10~9个／100ml PDB-1a，与对照(PDB)相比，生物产量提高了40.4％，孢子产量提高了260.9％。以含0.75‰琼脂粉的PDB-1a为培养液，研究了ZS-1菌株生长和产孢时间动态、接种量和装液量对产孢的影响，并以琼脂粉的添加量、接种量和培养时间为影响因子，进行了正交实验并对结果进行了分析。发现ZS-1菌株生长速度加快，生物产量及产孢于第8d达到高峰，而对照中于第11d生物产量和产孢的高峰期，缩短3d；装液量对生长和产孢均有显著影响，其中于250ml三角瓶中添加100mlPDB-1a，菌株的生物产量达614.5±9.3mg，产孢达(6.2±0.2)×10~9个／100mlPDB-1a。接种量对菌株的生物产量和产孢有显著的影响，其中最佳接种量是6ml孢子悬液／100ml PDB-1a(孢子悬液的浓度为10~7孢子／ml PDB)，此时，生物产量为619.1±10.8g，产孢量为(6.2±0.1)×10~9个／100ml PDB-1a。正交分析发现，在含0.75‰琼脂粉的PDB-1a为培养液、接种量为6ml孢子悬液／100ml PDB-1a(孢子悬液的浓度为10~7孢子／ml PDB)、培养时间为8d的综合条件下液体振荡培养，菌株生长和产孢最好。研究发现0.75‰PDB-1a对盾壳霉其它2个能在液体振荡培养条件下产孢的菌株(CM37和CM38)的生物产量和产孢都有显著的促进作用；对在液体振荡培养条件下不产孢的菌株Chy-1可以明显促进其生物产量的提高，但不能促使其产孢，表明PDB中添加少量的琼脂粉从本质上不能诱导盾壳霉产孢。研究还发现PDB-1a对草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、木霉(Trichoderma spp)和禾谷镰孢菌(Fusarium.graminearum)等4种丝孢纲真菌的生长也有显著的影响。这表明在PDB中添加少量的琼脂粉对真菌于液体振荡培养下生长的促进作用可能具有普遍作用。本文对盾壳霉孢子形成的分子机理研究提供基因材料和思路；同时对该生防菌的规模化生产等深入研究有较重要的理论意义和实践价值。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-18
  1 核盘菌及其作物菌核病  10-11
    1.1 核盘菌的分类地位及危害  10
    1.2 核盘菌的生物学特性  10
    1.3 作物菌核病的防治  10-11
  2 盾壳霉的研究进展  11-15
    2.1 盾壳霉的生物学特性  12
    2.2 盾壳霉的生态学特性  12-13
    2.3 盾壳霉的分子生物学研究  13
    2.4 盾壳霉的规模化生产  13-14
      2.4.1 国内外一些常见生防真菌发酵条件的研究  13-14
      2.4.2 盾壳霉的规模化生产  14
    2.5 盾壳霉的生防前景  14-15
  3 真菌孢子形成机理的研究  15-17
  4 本项研究的意义  17-18
第二章 盾壳霉产孢相关基因的克隆  18-39
  1 材料与方法  18-26
    1.1 材料  18-20
      1.1.1 菌株  18
      1.1.2 培养基、载体、抗性标记、缓冲液及其它试剂  18-19
      1.1.3 酶、试剂盒及其它试剂  19
      1.1.4 引物  19-20
    1.2 方法  20-26
      1.2.1 菌株的形态特征观察  20
      1.2.2 生长速度测定  20
      1.2.3 产生抗生物质的测定  20-21
      1.2.4 菌株培养(用于基因组DNA的提取)  21
      1.2.5 基因组DNA的提取  21
      1.2.6 Southern杂交分析  21-23
        1.2.6.1 酶切、电泳、转膜及固定  21-22
        1.2.6.2 预杂交  22
        1.2.6.3 探针标记及杂交  22-23
      1.2.7 TAIL-PCR克隆T-DNA侧端序列  23-24
      1.2.8 目的片段的回收及纯化  24-25
      1.2.9 回收产物与克隆载体连接  25
      1.2.10 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物  25
      1.2.11 重组质粒的筛选、提取及鉴定  25-26
      1.2.12 克隆序列分析  26
      1.2.13 CMPEX2功能初步验证  26
  2.结果与分析  26-36
    2.1 菌株的形态特征观察  26-27
    2.2 生长速度测定结果  27-28
    2.3 产生抗生物质能力的测定结果  28
    2.4 菌株培养与DNA的提取  28
    2.5 盾壳霉产孢缺陷型突变体菌株ZS-1T16229的DNA杂交分析  28-29
    2.6 TAIL-PCR产物电泳分析  29
    2.7 TAIL-PCR扩增T-DNA标记右端基因组DNA的克隆鉴定  29-31
    2.8 TAIL-PCR扩增DNA的序列分析  31
    2.9 CMPEX2功能分析  31
    2.10 T-DNA标记插入破坏CMPEX2位点预测  31
    2.11 CMPEX2功能初步验证结果  31-36
  3 结论和讨论  36-39
    3.1 结论  36-37
    3.2 讨论  37-39
第三章 盾壳霉ZS-1菌株液体产孢条件的优化  39-55
  1 材料及方法  39-41
    1.1 菌种与培养基  39
      1.1.1 菌种  39
      1.1.2 培养基  39
    1.2 方法  39-41
      1.2.1 盾壳霉孢子悬液的制备  39-40
      1.2.2 琼脂粉对ZS-1菌株在PDB-la中生长和产孢影响的测定  40
      1.2.3 PDB-Ia对盾壳霉ZS-1菌株分生孢子生长周期的影响  40
      1.2.4 不同装液量对盾壳霉ZS-1菌株孢子产量的影响  40
      1.2.5 不同接种量对盾壳霉ZS-1菌株孢子产量的影响  40-41
      1.2.6 促进盾壳霉ZS-1菌株产孢的复合因子筛选  41
      1.2.7 0.75％PDB-la对盾壳霉不同菌株生物产量及产孢量的影响  41
  2.结果与分析  41-51
    2.1 不同琼脂粉添加量对盾壳霉ZS-1菌丝生长及产孢的影响  41-43
    2.2 盾壳霉ZS-1菌株在0.75％PDB-la中生长和产孢动态  43-44
    2.3 装液量对盾壳霉ZS-1菌株分生孢子产生及生物量的影响  44-46
    2.4 不同接种量对盾壳霉ZS-1分生孢子及菌丝产量的影响  46-47
    2.5 促进盾壳霉ZS-1产孢的复合因子的筛选  47-49
    2.6 0.75％PDB-la对盾壳霉不同菌株分生孢子及菌丝产量的影响  49-51
  3 结论和讨论  51-55
    3.1 结论  51-52
    3.2 讨论  52-55
结论与展望  55-57
参考文献  57-64
致谢  64

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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