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盾壳霉产孢相关基因的克隆及腺苷脱氨酶(CMADA)基因的初步研究

作　者: 王萍萍
导　师: 付艳苹
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 农杆菌介导转化(ATMT) 反向PCR 分生孢子形成 腺苷脱氨酶(CMADA) 核盘菌
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


为了发挥盾壳霉的生防作用,有必要深入研究盾壳霉的分子生长发育、生理代谢途径及产孢调控。本研究以盾壳霉ZS-1菌株为出发菌株,在前期基础上进一步优化农杆菌介导的转化条件,将转化效率提高至50转化子/培养皿,既保证了转化效率,又可避免两个单孢萌发的菌丝长到一起,保证了转化子的纯度。通过这种方法构建了含5000个转化子的盾壳霉T-DNA标记插入突变体库。以期获得大量突变体克隆相关基因,研究基因功能。随后我们自盾壳霉的插入突变体库中共筛选到了23株表型异常突变体,其中8株突变体在PDA平皿上完全不能产生分生孢子,10株产孢明显减少,6株产生色素异常,3株生长迅速,3株生长缓慢,2株菌丝塌陷。其中产孢缺陷型突变体在菌丝生长速度、产抗生物质、寄生菌核能力和菌落形态等方面存在差异显著性。利用反向PCR、cDNA文库等克隆基因的技术平台,克隆了5株突变体的相关基因,包括ZS-1TN29、ZS-1TN289、ZS-1TN5012、ZS-1TN5498和ZS-1TN6222,利用NCBI保守结构域数据库比较分析,编码蛋白分别推定为CMARGJ、CMGAL、CMHMGR、CMPurD、CMMAPKKK。对突变体ZS-1TN250进行了详细研究,发现该突变体生长速度迅速,但在PDB中的生物产量比野生菌株低；产孢明显减少,后期有少量孢子产生,显微观察发现大部分孢子没有黑色素化；该突变体能寄生核盘菌,但在菌核上不产生分生孢子,致腐菌核能力显著下降；可以正常产生抗生物质。采用反向PCR技术对ZS-1TN250中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组DNA进行克隆,获得了大小为902bp的DNA片段,结合盾壳霉基因组序列分析,利用DNA MANagement软件进行全长序列拼接,得到该基因全长1522bp,包含4个外显子和3个内含子,cDNA全长为996 bp,推定编码含332个氨基酸的蛋白,T-DNA插入到第二个外显子上191nt的位置。通过NCBI BLASTP数据库,对推定编码的氨基酸序列进行分析,与adenosine/AMP deaminase family protein (Pyrenophora tritici-repentis)具有最高相似度,在蛋白水平上相似性达61%,故命名该基因为CMADA。进一步设计引物,自盾壳霉cDNA文库扩增得到3’末端。Southern杂交证实T-DNA标记在ZS-1TN250中为单拷贝。RT-PCR检测到CMADA基因在野生菌株中的积累,但在突变体ZS-1TN250中没有检测信号。用腺苷脱氨酶试剂盒测定ADA的活性,在野生菌株中可检测到该酶的活性,而突变体ZS-1TN250中未能检测到该酶的活性。因此,推定突变体表型的变化是由于T-DNA插入造成的,CMADA基因与盾壳霉的菌丝生长和孢子形成相关。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章 文献综述  11-21
  1 核盘菌的研究进展  11-13
    1.1 核盘菌及其危害  11
    1.2 作物菌核病的防治  11-13
      1.2.1 抗病育种  12
      1.2.2 农业栽培措施  12
      1.2.3 化学防治  12
      1.2.4 生物防治  12-13
  2 盾壳霉的研究进展  13-16
    2.1 盾壳霉的生物学特性  13-14
    2.2 盾壳霉的生物防治作用研究  14-15
    2.3 盾壳霉的分生孢子研究进展  15-16
  3 农杆菌介导的真菌遗传转化研究  16-18
  4 反向PCR的研究进展  18-19
  5 腺苷脱氨酶的研究进展  19-20
  6 研究的目的和意义  20-21
第二章 盾壳霉T-DNA插入体库的建立及突变体相关基因的克隆  21-38
  1 材料与方法  21-27
    1.1 材料  21-23
      1.1.1 菌株  21
      1.1.2 培养基  21-22
      1.1.3 抗生素及其他试剂  22-23
      1.1.4 酶、试剂盒及其它试剂  23
      1.1.5 引物  23
    1.2 方法  23-27
      1.2.1 农杆菌介导转化盾壳霉  23-24
      1.2.2 突变体的保存、筛选及分类  24
      1.2.3 5株突变体DNA的提取  24
      1.2.4 反向PCR克隆T-DNA两侧翼序列  24-25
      1.2.5 目的片段的回收及纯化  25
      1.2.6 回收产物与克隆载体连接  25
      1.2.7 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物  25-26
      1.2.8 重组质粒的筛选及PCR鉴定  26
      1.2.9 克隆序列分析  26-27
  2 结果与分析  27-33
    2.1 突变体的保存、筛选及分类  27-28
    2.2 5株产孢异常突变体的表型  28-29
    2.3 反向PCR克隆T-DNA插入位点侧端DNA  29-30
    2.4 相关基因的生物信息学分析  30-33
  3 结论和讨论  33-38
第三章 盾壳霉突变体ZS-1TN250菌株的研究  38-57
  1 材料与方法  38-45
    1.1 材料  38-39
      1.1.1 试验菌株  38
      1.1.2 培养基  38
      1.1.3 质粒抽提用溶液  38-39
      1.1.4 Southern杂交用溶液及试剂  39
      1.1.5 其它溶液及试剂  39
    1.2 试验方法  39-45
      1.2.1 突变体菌株ZS-1TN250的形态特征观察和生长速度测定  39-40
      1.2.2 ZS-1TN250生物产量测定  40
      1.2.3 突变体菌株ZS-1TN250寄生致腐核盘菌菌核能力测定  40
      1.2.4 ZS-1TN250产抗生物质能力测定  40-41
      1.2.5 Southern杂交验证突变体中T-DNA的插入拷贝数  41-42
      1.2.6 反向PCR克隆T-DNA插入位点侧端DNA  42
      1.2.7 在cDNA文库中扩增3'末端  42-43
      1.2.8 ZS-1TN250相关基因的生物学信息分析  43
      1.2.9 ZS-1和ZS-1TN250菌株总RNA的提取  43-44
      1.2.10 RT-PCR验证表达情况  44
      1.2.11 酶比色法测定腺苷脱氨酶活性  44
      1.2.12 数据统计分析  44-45
  2 结果与分析  45-55
    2.1 ZS-1TN250菌株的形态特征  45-47
    2.2 ZS-1TN250菌丝生长速度的测定  47
    2.3 ZS-1TN250的生物产量测定  47-48
    2.4 ZS-1TN250寄生致腐核盘菌菌核能力的测定  48-49
    2.5 ZS-1TN250产抗生物质能力测定  49-50
      2.5.1 ZS-1TN250在PDA和MCD培养基上均没有产抗真菌物质能力  49
      2.5.2 ZS-1TN250具有有产抗细菌物质能力  49-50
    2.6 Southern杂交分析ZS-1TN250中T-DNA插入为单拷贝  50-51
    2.7 反向PCR克隆T-DNA插入位点侧端DNA  51-52
    2.8 CMADA全长序列分析  52-53
    2.9 在cDNA文库中扩增3'末端  53-54
    2.10 CMADA基因在ZS-1TN250和ZS-1中的表达  54-55
    2.11 酶比色法测定腺苷脱氨酶活性  55
  3 结论和讨论  55-57
结论与展望  57-60
参考文献  60-70
致谢  70

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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