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一株鞘氨醇单胞菌对多环芳烃的降解特性及菲降解途径研究

作　者: 雷欢
导　师: 田蕴
学　校: 厦门大学
专　业: 水生生物学
关键词: 多环芳烃 生物降解 菲 鞘氨醇单胞菌 双加氧酶 表达蛋白质组 代谢途径
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 230次
引　用: 2次
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内容摘要


多环芳烃是一类在环境中有广泛分布的有机化学污染物,具有“三致”性（致畸、致突变、致癌）,通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。微生物修复是消除PAHs污染的有效方式。研究降解菌的遗传控制、探索代谢途径、解析相关酶系和功能基因,从而构建基因工程菌株用于污染环境的生物修复是当前研究的热点。本论文对一株筛选自厦门博坦油码头表层海水的高效菲降解细菌Sphingomonas sp.H的生理生化特征、对PAHs的降解特性、降解条件、降解关键酶基因、差异表达蛋白质组等方面进行了较为系统的研究,获得的主要结果如下:1.降解能力测定显示,鞘氨醇单胞菌H能以菲和荧蒽作为唯一碳源生长,并能利用PAHs代谢途径中的中间产物,包括2—萘酚、水杨酸、邻苯二酚、苯酚和原儿茶酸。利用均匀设计对鞘氨醇单胞菌H降解菲的条件进行优化,DPS软件数据处理系统分析表明在接种量OD600为0.5,菲起始浓度为498.467 mg L-1,降解时间为47.099 h时,降解速率最大为8.104 mgL(-1(h-1,降解率可达76.6%。2.通过引物设计的方法,从鞘氨醇单胞菌H中扩增得到全长的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因（C230）,从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚-2,3-双加氧酶（C230）在鞘氨醇单胞菌H中的存在。对C230基因构建了重组表达载体,成功在表达宿主大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中进行表达,基因在宿主中以溶解蛋白和包涵体形式同时存在。可以进一步推断鞘氨醇单胞菌H降解菲的基本途径是在C230的作用下经由水杨酸途径问位裂解（meta-cleavage）苯环,生成2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）,从而降解菲。3.采用2-DE（双向凝胶电泳）结合LC-MS/MS（串联质谱）,研究鞘氨醇单胞菌H在菲诱导与无菲诱导（对照）状况下的蛋白质表达,对差异蛋白的生物质谱结果进行分析,得到多个代谢途径中的关键酶（加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等）,结合鞘氨醇单胞菌H的降解特性与降解基因的研究结果,最终推导出鞘氨醇单胞菌H降解菲较为完整的代谢途径。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-14
第一章 前言  14-39
  1 多环芳烃的来源与危害  14-15
    1.1 多环芳烃的来源  14-15
    1.2 多环芳烃的危害  15
  2 多环芳烃污染环境的生物修复  15-19
    2.1 降解PAHs的微生物  18
    2.2 影响微生物修复PAHs的因子  18-19
  3 菲的微生物降解及相关的降解途径  19-28
    3.1 降解菲的微生物  20-26
    3.2 细菌对菲的降解途径研究  26-28
  4 多环芳烃降解途径的研究方法  28-36
    4.1 化学分析方法  28-29
    4.2 基因组学研究方法  29-31
    4.3 蛋白质组学方法在多环芳烃生物降解代谢途径研究中的应用  31-36
  5 本论文的研究内容及意义  36-39
第二章 材料与方法  39-60
  1 材料  39-46
    1.1 降解菌株  39
    1.2 菌体和质粒  39
    1.3 主要试剂  39-40
    1.4 主要仪器  40-41
    1.5 PCR引物  41
    1.6 主要培养基  41-42
    1.7 溶液配制  42-46
  2 基本方法  46-60
    2.1 鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化  46-48
    2.2 降解菌基因文库的构建  48-51
    2.3 降解关键酶基因的克隆与表达  51-55
    2.4 鞘氨醇单胞菌H的蛋白质组学实验  55-60
第三章 结果与分析  60-91
  第一节 鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化  60-67
    1 鞘氨醇单胞菌H的分子鉴定  60
    2 鞘氨醇单胞菌H的生理生化特性  60
    3 鞘氨醇单胞菌H对不同PAHs的降解  60-65
    4 降解菌对菲降解条件的优化  65-67
  第二节 鞘氨醇单胞菌H基因文库的构建及降解关键酶基因的克隆与表达  67-76
    1 基因组(3-10 kb)文库构建  67-71
    2 鞘氨醇单胞菌H降解关键酶基因的克隆与表达  71-76
  第三节 运用双向电泳技术追踪鞘氨醇单胞菌H降解PAHs过程中的差异表达蛋白  76-91
    1 降解过程中菌体蛋白提取方法的优化  76-80
    2 菲诱导下鞘氨醇单胞菌H的蛋白表达  80
    3 LC-MS/MS分析  80-87
    4 与菲代谢相关的蛋白质鉴定  87-89
    5 鞘氨醇单胞菌H降解菲的代谢途径推测  89-91
第四章 讨论  91-98
  1 均匀设计在降解菌对多环芳烃降解条件优化上的应用  91-92
  2 降解关键酶基因的克隆、表达与同源性分析  92-93
  3 细菌全蛋白提取方法  93
  4 鞘氨醇单胞菌H降解菲的降解途径推测  93-98
    4.1 鞘氨醇单胞菌H对PAHs降解过程中的中间代谢产物的利用  94-95
    4.2 PAHs降解关键酶基因的克隆与表达  95
    4.3 差异表达蛋白组学的研究  95-98
第五章 结论与展望  98-101
  1 结论  98
  2 本论文创新点  98-99
  3 展望  99-101
参考文献  101-113
附录  113-118
  附录一 参与的科研课题、发表和待发表的学术论文  113-114
  附录二 载体图谱  114-116
  附录三 缩略语对照表  116-118
致谢  118

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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