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南极深海底泥中性嗜盐菌Chromhalobacter sp.NJS-2四氢嘧啶生物合成基因ectABC的克隆表达及四氢嘧啶生物学功能初步研究

作　者: 傅英楠
导　师: 杨丰；陈荣忠
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物药物学
关键词: 南极中度嗜盐菌相容性溶质四氢嘧啶盐适应机制
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

南极普里兹湾特定的地理环境和海底地形特点,能够长久保持高盐、低温、大密度等特点,其海底沉积物的微生物往往具有适应特殊环境的生理学上的特异性。其特定的生态环境蕴藏着独特而又极其丰富的微生物资源,其中大部分还鲜为人知,这为研究中度嗜盐菌盐适应机制开辟了一个崭新的平台。对普里兹湾深海沉积物中筛选到的中度嗜盐菌色盐杆菌NJS-2(Chromohalobacter sp.NJS-2)进行分类鉴定并分析其主要累积的相容性溶质种类及浓度。NJS-2主要累积相容性溶质为四氢嘧啶(ectoine),其次是谷氨酸(Glutamate)。根据四氢嘧啶合成基因ectABC的蛋白氨基酸的保守序列,设计了多对引物,以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经过序列测定和Blast分析,确定其为ectABC基因的部分序列。经过多次PCR和反向PCR,最终获得了一个全长2379bp的DNA片段。初步分析该片段含有编码四氢嘧啶生物合成途径中的三个酶的基因,ectA、ectB、ectC及上下游序列。对ectA、ectB、ectC进行克隆及诱导表达,分离纯化后得到四氢嘧啶生物合成途径中的三个重组蛋白酶,EctA,EctB和EctC。分别加入各自底物,测定酶活力来验证其反应方程式,从而在体外验证了该菌株四氢嘧啶生物合成途径。分析这三个重组蛋白酶发现,具有相似的酶学性质。四氢嘧啶在保护生物大分子上具有独特的功效,因此,我们研究了四氢嘧啶对Cu-Zn型SOD酶在热处理条件下的保护作用。研究结果表明,四氢嘧啶对经热处理的Cu-Zn型SOD酶有明显的保护作用。四氢嘧啶与脯氨酸、甘油、海藻糖、谷氨酸、甜菜碱,在相同热处理条件下比较,四氢嘧啶对Cu-Zn型SOD酶的热保护作用最为明显,且用量最少。另外,我们还分析了NJS-2在高渗环境下诱导合成的相容性物质四氢嘧啶对微生物细胞耐热性的影响。经10%NaCl诱导培养的耐盐细菌NJS-2,因细胞内积累了四氢嘧啶而获得耐热性。在供试的非四氢嘧啶合成菌株的热处理体系中,外源加入四氢嘧啶,能够提高细胞的耐热性。不同的微生物细胞在特定的处理温度下,其最佳热保护效果的四氢嘧啶添加浓度不同。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
1 前言  11-40
  1.1 中度嗜盐菌的研究进展  11-24
    1.1.1 中度嗜盐菌的研究历史  12
    1.1.2 中度嗜盐菌的生态环境及与其生态环境相适应的生理学特点  12-15
    1.1.3 中度嗜盐菌的种类组成  15-17
    1.1.4 中度嗜盐菌的嗜盐机制及渗透压调节  17-18
    1.1.5 中度嗜盐菌的应用  18-24
  1.2 中度嗜盐菌相容性溶质的研究进展  24-37
    1.2.1 相容性溶质的种类及特点  24-28
      1.2.1.1 糖类及糖苷类  24-25
      1.2.1.2 甜菜碱类  25-26
      1.2.1.3 氨基酸及其衍生物  26-27
      1.2.1.4 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶  27-28
      1.2.1.5 其它  28
    1.2.2 相容性溶质作用的分子机制  28-30
    1.2.3 相容性溶质的合成与转运机理  30-36
      1.2.3.1 甘氨酸甜菜碱的转运与合成  30-31
      1.2.3.2 甜菜碱的合成  31-33
      1.2.3.3 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的转运与合成  33-36
    1.2.4 相容性溶质的生物学功能  36-37
  1.3 极端微生物简介  37
  1.4 南极普立兹湾生态环境简介  37-39
    1.4.1 南极概况  37-38
    1.4.2 南极普立兹湾生态环境研究进展  38-39
  1.5 本文的研究目的及意义  39-40
2 材料与方法  40-58
  2.1 材料  40-47
    2.1.1 实验材料、菌株和质粒  40
    2.1.2 酶  40
    2.1.3 引物  40-41
    2.1.4 其它试剂  41
    2.1.5 主要仪器设备  41-42
    2.1.6 培养基的配置  42-44
    2.1.7 缓冲液及其它常用溶液的配置  44-47
    2.1.8 主要的分析软件  47
  2.2 方法  47-58
    2.2.1 基本方法  47-51
    2.2.2 菌株NJS-2的分离筛选及生理生化分析  51-52
    2.2.3 四氢嘧啶的分离纯化及测定  52-53
    2.2.4 菌株NJS-2的系统发育分析  53
    2.2.5 四氢嘧啶合成基因ectABC基因的克隆及测序  53-55
    2.2.6 ectA、ectB和ectC基因的重组表达及蛋白纯化  55-56
    2.2.7 EctA、EctB和EctC的酶活测定  56-57
    2.2.8 四氢嘧啶对Cu—Zn型SOD酶热稳定性的影响  57
    2.2.9 四氢嘧啶对微生物细胞耐热性的影响  57-58
3 结果与分析  58-74
  3.1 ectABC基因的功能研究  58-68
    3.1.1 NJS-2菌株的分离鉴定  58-64
    3.1.2 ectABC基因结构及功能分析  64-67
    3.1.3 ectA、ectB和ectC基因的重组表达及蛋白纯化分析  67-68
    3.1.4 EctA、EctB和EctC的酶学性质分析  68
  3.2 四氢嘧啶生物学功能的研究  68-74
    3.2.1 四氢嘧啶对Cu—Zn型SOD酶的热保护作用  68-70
    3.2.2 四氢嘧啶对微生物细胞的热稳定作用  70-74
4 讨论  74-76
5 小结与展望  76-77
  小结  76
  展望  76-77
攻读硕士学位期间研究成果  77-78
参考文献  78-87
致谢  87

南极深海底泥中性嗜盐菌Chromhalobacter sp.NJS-2四氢嘧啶生物合成基因ectABC的克隆表达及四氢嘧啶生物学功能初步研究

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