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黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质和抑癌作用研究

作　者: 吴艳玲
导　师: 谭竹钧
学　校: 广东工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 黄粉虫纤溶活性蛋白酶学性质米氏常数Km 丝氨酸蛋白酶抑癌作用
分类号: S899.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

黄粉虫富含蛋白质等多种营养成分,是一种宝贵的食用昆虫资源,己在人类食品上、保健品、医药和饲料等方面得到广泛应用。黄粉虫生存能力和适应能力强、生长发育快、养殖成本低等优点,己成为当今世界上仅次于养蚕、养蜂业发展最快的养虫业之一。已经证明从黄粉虫体内提取出一种活性蛋白,具有很好的溶血栓作用,而癌症和心血管疾病是目前世界上两大生命杀手,希望通过进一步研究该活性蛋白,提供更加完善的基础实验数据,为以后找出一种高效、安全、低价的治疗药物打下基础。本文经匀浆浸提、盐析、阴离子交换和葡聚糖凝胶过滤等方法,从黄粉虫幼虫体内提取分离纯化出一种纤溶活性蛋白(Tenebrio Fibrinolyric Proteins, TFP)纤维平板法显示其有很好的纤溶效果,非变性电泳证明其纯度,为单一组分,变性电泳测出其相对分子量约为56.1kD,蛋白质浓度为6.061mg·mL-1。为进一步了解该酶的酶学性质,本文通过TFP作用于3种底物(BAEE、BAPNA和酪蛋白),测定不同米氏常数Km值,其中以BAEE为底物时Km值为0.182mmol/L,显著小于BAPNA为底物的Km值(1.138 mmol/L),而以酪蛋白为底物时测不出Km值。TFP作用于BAEE时使BAEE上的酯键断裂,表现出酯酶活力；作用于BAPNA时使BAPNA上的酰胺键断裂,表现为非肽类酰胺键的酰胺酶活力；而作用于酪蛋白和纤维蛋白时裂解肽键,表现为肽键酶活力,所以得出：TFP的酯酶活力>酰胺酶活力>肽键酶活力。模拟小肠环境,偏碱性,TFP未被胰蛋白酶降解,可以做肠溶性制剂。为了探讨TFP的酶学种类,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF作用于TFP,纤维平板法测抑制酶活性,研究结果表明PMSF浓度为5mmol/L可完全抑制TFP纤溶活性,表明PMSF能有效抑制TFP纤溶活性,其对TFP的抑制作用与其浓度呈正相关。同时根据红外光谱检测结果,表明胰蛋白酶与TFP的结构很接近,而胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,蛋白酶活性部位在种系进化上具有严格保守性,因而初步推断TFP也属于丝氨酸蛋白酶。本文还尝试性的对TFP的抗癌作用作了初步研究,通过体外培养动物癌细胞,MTT法检测,结果显示,黄粉虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞A549细胞有较显著的抑制作用,对H22细胞抑制作用不明显,对于癌细胞有选择性。另外,比较TFP和抗癌药物顺铂对肿瘤细胞A549的作用效果,得出：TFP抗癌效果很迅速,短时间就能达到较好的抑制肿瘤生长的效果,这是其它抗癌药物不可比拟的优势。可能两者作用机理不一样,还有待继续深入研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
Catalogue  11-14
缩写  14-15
第一章绪论  15-25
  1.1 概述  15-16
  1.2 黄粉虫研究与利用现状  16-20
    1.2.1 黄粉虫在国内各个领域的研究利用现状  16-19
    1.2.2 黄粉虫在国外各个领域的研究利用现状  19-20
  1.3 血栓形成机理及血栓病  20-21
    1.3.1 血栓形成机理  20-21
    1.3.2 栓类疾病  21
  1.4 抗血栓药物  21-23
    1.4.1 抗血栓药物来源与分类  21-22
    1.4.2 抗血栓药物的特点  22-23
  1.5 纤溶酶抗肿瘤机制  23
  1.6 论文研究意义及主要研究内容  23-25
    1.6.1 研究意义  23-24
    1.6.2 研究内容  24-25
第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定  25-39
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 主要实验材料和试剂  25-26
    2.1.2 主要仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-34
    2.2.1 黄粉虫纤溶活性蛋白的分离  27
    2.2.2 黄粉虫纤溶活性蛋白纯化  27-28
    2.2.3 活性蛋白纯度的鉴定  28-29
    2.2.4 纤溶活性的测定  29-30
    2.2.5 黄粉虫活性蛋白分子量检测  30-33
    2.2.6 样品蛋白含量的检测  33-34
  2.3 实验结果与讨论  34-38
    2.3.1 黄粉虫纤溶活性蛋白的分离纯化  34-36
    2.3.2 黄粉虫纤溶活性蛋白分子量的测定  36-37
    2.3.3 黄粉虫纤溶活性蛋白中蛋白质含量测定  37-38
  2.4 本章小结  38-39
第三章黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质研究  39-57
  3.1 实验材料  39-40
    3.1.1 主要实验仪器  39
    3.1.2 主要实验试剂  39-40
  3.2 实验方法  40-46
    3.2.1 以BAEE作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋白(TFP)的米氏常数(Km)  40-43
    3.2.2 以BAPNA作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋白(TFP)的米氏常数(Km)  43-44
    3.2.3 以酪蛋白作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋白(TFP)的米氏常数(Km)  44-45
    3.2.4 PMSF对TFP纤溶活性的影响  45
    3.2.5 胰酶对TFP的影响  45
    3.2.6 胰酶和TFP的红外光谱检测  45-46
  3.3 实验结果与讨论  46-55
    3.3.1 黄粉虫纤溶活性蛋白(TFP)的紫外吸收光谱  46
    3.3.2 温度和pH对黄粉虫纤溶活性蛋白的影响  46-47
    3.3.3 以BAEE为底物测TFP的Km值  47-49
    3.3.4 以BAPNA为底物测TFP的Km值  49-50
    3.3.5 以酪蛋白为底物测TFP的Km值  50-51
    3.3.6 PMSF抑制酶活性  51-52
    3.3.7 胰酶对黄粉虫纤溶活性蛋白酶的影响  52-54
    3.3.8 黄粉虫纤溶活性蛋白(TFP)和胰蛋白酶的红外光谱图分析  54-55
  3.4 本章小结  55-57
第四章黄粉虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞作用的研究  57-65
  4.1 实验材料  57-58
    4.1.1 主要实验仪器  57
    4.1.2 主要实验试剂  57-58
  4.2 实验方法  58-61
    4.2.1 细胞培养准备工作  58-59
    4.2.2 细胞培养实验方法  59-61
    4.2.3 统计学处理  61
  4.3 实验结果与讨论  61-64
    4.3.1 黄粉虫纤溶活性蛋白对H_(22)细胞增殖的抑制作用  61-62
    4.3.2 黄粉虫纤溶活性蛋白对A_(549)细胞增殖的抑制作用  62-64
  4.4 本章小结  64-65
结论与展望  65-67
  1 结论与讨论  65-66
  2 展望  66-67
参考文献  67-73
攻读硕士学位期间发表的论文  73-75
致谢  75

黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质和抑癌作用研究

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