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短小芽孢杆菌胞内NADPH 的再生及羟基脂肪酸发酵优化的研究

作　者: 吴立新
导　师: 吴祖芳
学　校: 宁波大学
专　业: 食品科学
关键词: ω-羟基脂肪酸短小芽孢杆菌发酵条件响应面法 NADPH再生
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

C18长碳链羟基脂肪酸中的ω-1、ω-2、ω-3-羟基脂肪酸(ω-1、ω-2、ω-3-HFA)可应用于机械、化工、食品等工业,是当今绿色聚合物材料研究开发中最理想的单体成分之一。本文以一株经过诱变后获得的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)突变菌株M-F641作为出发菌株,为了能够进一步提高油酸转化率和羟基脂肪酸得率,对其生长和代谢规律进行了研究,并在单因素(培养温度、初始pH和装液量)实验的基础上采用响应面分析法,以油酸转化率作为指标,优化了发酵工艺条件,并对优化后的发酵条件进行了验证。在对碳源代谢研究的基础上,确定了最佳碳源为葡萄糖,并结合胞内微生物糖发酵代谢途径的分析,建立了一种以木糖为辅助底物实现辅酶NADPH再生的新方法。本文主要研究结果如下:(1)通过对碱法和酸法两种不同的甲酯化方法进行比较,得出以酸法进行甲酯化,并通过正交实验(酯化时间、温度、硫酸-甲醇体积比),确定了以硫酸-甲醇法对脂肪酸进行甲酯化的最佳条件为2%硫酸-甲醇,70℃水浴1h。(2)通过对短小芽孢杆菌突变株M-F641生长和代谢规律的研究,得出其生长所需的最适碳源为葡萄糖,最适葡萄糖浓度为20g/L,并结合胞内葡萄糖代谢规律的分析,以木糖(木糖添加量10g/L)为辅助底物进行辅酶NADPH的再生。与不添加木糖(0g/L)的对照组相比,NADPH的含量增加了0.0345mmol/L,增加率为40.68%;并且与对照组(油酸转化率70.04%,ω-羟基脂肪酸得率18.90%)相比,油酸转化率(75.31%)和ω-羟基脂肪酸得率(22.61%)也都有了较大的提高,有效地实现了辅酶NADPH的再生。(3)短小芽孢杆菌突变株M-F641最佳发酵工艺条件的确定。在单因素(培养温度、初始pH和装液量)实验的基础上,通过响应面优化法,确定了BP M-F641最佳发酵工艺条件:装液量为60mL/250mL,温度30℃,pH值7.4,在此条件下,NADPH含量最大值为0.0268mmol/L,测得油酸转化率为74.58%。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 绪论  11-23
  1.1 羟基脂肪酸概述  11
  1.2 羟基脂肪酸的主要来源  11-13
    1.2.1 化学合成途径  12
    1.2.2 生物合成途径  12-13
  1.3 合成羟基脂肪酸的微生物  13
  1.4 脂肪酸羟基化反应的作用机制  13-15
    1.4.1 微生物中羟化酶的分类及其特点  13-14
    1.4.2 微生物中羟化酶的作用机制  14-15
    1.4.3 P450 单加氧酶系在微生物细胞中的分布  15
  1.5 辅酶NADPH 的性质  15-16
  1.6 辅酶NADPH 在体内的代谢产生途径  16-18
    1.6.1 HMP 途径（单磷酸己糖途径）  16-17
    1.6.2 ED 途径（2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径）  17-18
  1.7 辅酶NADPH 的再生方法  18-21
    1.7.1 辅酶的酶反应再生  18-19
    1.7.2 辅酶的化学法再生  19
    1.7.3 辅酶的电化学法再生  19-20
    1.7.4 辅酶的光化学法再生  20
    1.7.5 辅酶的微生物法再生  20-21
  1.8 研究依据、目的和内容  21-23
2 脂肪酸甲酯化条件的确立和发酵产物的鉴定  23-33
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 主要仪器设备  24
    2.1.2 主要试剂  24
    2.1.3 硫酸-甲醇溶液的制备  24-25
    2.1.4 气相色谱条件  25
    2.1.5 油酸及其衍生物含量测定  25
    2.1.6 样品油酸的衍生化方法  25
    2.1.7 发酵液中油酸衍生物（ω-羟基脂肪酸）的提取和甲酯化  25-26
  2.2 结果与分析  26-32
    2.2.1 油酸和棕榈酸标准品气相色谱图  26-27
    2.2.2 硫酸-甲醇浓度（V/V）对油酸甲酯化的影响  27-28
    2.2.3 温度对油酸甲酯化的影响  28-29
    2.2.4 反应时间对油酸甲酯化的影响  29
    2.2.5 硫酸-甲醇法用于油酸甲酯化的正交优化实验  29-31
    2.2.7 GC-MS 测定发酵产物  31-32
  2.3 本章小结  32-33
3 Bacillus pumilus 胞内辅酶 NADPH 再生构建与机理分析  33-44
  3.1 材料与方法  33-38
    3.1.1 主要仪器设备  33-34
    3.1.2 主要试剂  34
    3.1.3 菌株和培养基  34-35
    3.1.4 菌种培养及发酵方法  35
      3.1.4.1 菌种活化及种子制备  35
    3.1.5 分析方法  35-38
      3.1.5.1 葡萄糖浓度标准曲线的制定及发酵液中葡萄糖含量的测定  35-36
      3.1.5.2 NADPH 标准曲线的制定及胞内NADPH 含量测定  36-37
      3.1.5.3 发酵液中羟基脂肪酸分析及含量测定  37-38
  3.2 结果与分析  38-42
    3.2.1 短小芽孢杆菌胞内葡萄糖代谢及脂肪酸转化途径分析  38-39
    3.2.2 不同装液量下葡萄糖代谢与短小芽孢杆菌胞内NADPH 含量  39-41
    3.2.3 木糖添加量对NADPH 含量及ω-羟基脂肪酸产量的影响  41-42
  3.3 本章小结  42-44
4 Bacillus pumilus M-F641 最佳发酵工艺的研究  44-56
  4.1 材料和方法  44-46
    4.1.1 主要仪器设备  44
    4.1.2 主要试剂  44-45
    4.1.3 菌种  45
    4.1.4 培养基  45
    4.1.5 硫酸甲醇溶液的配置  45
    4.1.6 菌种活化及种子制备  45
    4.1.7 细胞生物量测定  45
    4.1.8 发酵液中羟基脂肪酸分析及含量测定  45
    4.1.9 单因素实验  45-46
    4.1.10 响应面实验分析  46
  4.2 结果与分析  46-54
    4.2.1 摇瓶培养条件下细胞生长曲线的测定  46-47
    4.2.2 碳源种类对菌体生长及油酸转化率的影响  47-48
    4.2.3 初始葡萄糖浓度对菌体生长及油酸转化率的影响  48
    4.2.4 培养温度对菌体生长及油酸转化率的影响  48-49
    4.2.5 培养基初始pH 值对菌体生长及油酸转化率的影响  49
    4.2.6 装液量对菌种转化油酸生成ω-羟基脂肪酸得率的影响  49-50
    4.2.7 响应面分析实验结果  50-54
      4.2.7.1 回归方程的建立与分析  50-52
      4.2.7.2 培养因素间交互作用分析与发酵条件的优化  52-54
      4.2.7.3 验证实验  54
  4.3 本章小结  54-56
5 结论和进一步研究设想  56-58
  5.1 实验结论  56
  5.2 进一步研究设想  56-58
参考文献  58-65
在学研究成果  65-66
致谢  66

短小芽孢杆菌胞内NADPH 的再生及羟基脂肪酸发酵优化的研究

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