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基因工程仿生蜘蛛丝蛋白中重复模块对成丝性质的影响

作　者: 汤传龙
导　师: 孟清
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蜘蛛鞭毛状丝重复模块 IMPACT 湿纺成丝性质
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

蜘蛛丝作为一种优越的蛋白质材料已经被发现可以应用于航天航空,生物医学工程,军工防弹衣等方面,但是由于蜘蛛的互相残杀习性,蜘蛛丝的获得不能通过类似于家蚕养殖的简单方式大量获得,20世纪末开始有科学家尝试在山羊、植物、昆虫等细胞中表达蜘蛛丝的基因,但是目前还是没有办法解决蜘蛛丝全长基因表达和蛋白产率低的问题。蜘蛛丝的基因主要由N端、C端非重复序列和中间的大量重复序列组成,目前对蜘蛛丝的研究主要分为：1,通过构建文库对不同种类蜘蛛不同类型蜘蛛丝全长基因的调取；2,研究蜘蛛丝蛋白成丝机理,主要涉及对N端、C端和中间序列在蜘蛛丝蛋白成丝过程中的作用,以及自组装过程中蛋白二级结构的变化；3,蜘蛛丝在生物医学工程方面的应用,主要涉及复合材料、药物缓释等内容。现在对蜘蛛丝的研究非常热,2010年连续在nature上发表了多篇关于蜘蛛丝成丝机理的研究论文。而且越来越多的人在关注蜘蛛丝在应用方面的研究,如Thomas R. Scheibel利用蜘蛛丝蛋白成丝的自组装来选择性包装和释放药物,可以在不同溶液中形成胶囊,可应用于药物缓释等方面。将蜘蛛丝蛋白溶液与现有的组织工程材料复合成新型的材料,期望得到更好组织相容性并可降解的材料,在替代性皮肤和手术缝合线方面会有很好的应用。目前已经有很多文献报道蜘蛛丝基因表达的N端非重复模块可能构成蜘蛛丝的分泌信号并且是pH敏感元件,但是更多的功能还没被发现,C端非重复模块可以控制蜘蛛丝蛋白的可溶性和纤维形成,在丝纤维自组装过程中都起到重要的作用,但是由于不同种类蜘蛛和不同蛛丝之间重复模块的同源性没有N端和C端高,重复模块分子量大、结构复杂,增加了对其研究的难度。重复模块在纤维形成的过程中的功能还有待进一步研究,本课题从分子水平和材料学水平上对不同数量重复模块成丝性质进行了研究。我们实验室在前期试验中,通过基因文库筛选得到一段大约693bp的大腹园蛛基因序列,经过分析和比对我们初步确认其为含有完整重复单元的鞭毛状丝基因。对这段基因根据原核生物大肠杆菌密码子使用频率进行基因优化后,依据鞭毛状丝的特点将这段基因分别拼接得到分别含有1-4段重复序列的质粒PE-Sc1/2/3/4,在重复片段的两端分别加上人工合成的蛛丝基因的N端和C端基因。将拼接得到的四段基因与IMPACT (Intein-Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统的PTWIN1质粒融合表达得到N-Sc1/2/3/4-C-Intein-CBD蛋白(质粒PT-N-Sc1/2/3/4-C),利用几丁质结合蛋白与几丁质树脂的特异性结合亲和层析得到N-Sc1/2/3/4-C-Intein-CBD蛋白,通过加入DTT诱导Intein发生N端断裂,得到N-Scl/2/3/4-C蛋白将纯化的蛋白透析至pH7.0的去离子水中,利用六氟异丙醇(HFIP)溶剂将冷冻干燥后的蛋白按照20%的质量体积分数回溶后,通过湿纺的手段得到四种单纤维类蜘蛛丝。组成丝纤维的四种丝蛋白单分子内N端和C端非重复结构的数量是一样的,不同的是逐渐增加的重复模块数量。通过对四种单丝的应力应变测试发现随着重复模块数增多,丝纤维的延展性越好,最好的是含有四段重复模块的丝纤维,应变程度可以达到25%。但是纤维的抗张强度并不是随着蛋白质分子量增加一直增强,含有四段重复模块的丝纤维应力为60MPa,而含有三段重复模块的丝纤维应力达到了120MPa,是含有四段重复模块丝纤维的两倍,说明重复模块对丝纤维强度并不是主要影响因素。再对四种单丝进行显微激光Raman测试,分析仿生蜘蛛丝的内部二级结构组成,通过研究发现四种重组蛛丝中,都含有α-helix、β-sheet、β-turn和random coil蛋白质二级结构。N端和C端非重复模块不是鞭毛状丝的基因(N端、C端和重复模块氨基酸序列见附录),主要组成α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲结构。四种丝纤维在蛋白质二级结构上,其α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲结构含量是大体一致的。鞭毛状丝重复模块氨基酸序列主要都是由GPGGX的结构组成,形成β-turn二级结构,在此基础上形成β-turn螺旋,该结构能增强丝纤维的弹性,再次证明了鞭毛状丝重复模块的增加可以增强仿生蛛丝的延展性。本课题主要从蛋白水平和材料学水平研究重复模块在成丝过程中的重要作用,期望能够为获得性能优越的仿生蛛丝的提供研究基础,同时也对基因工程仿生蛛丝的应用提供一种新的思路。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词表  10-11
第1章绪论  11-33
  1.1 引言  11-12
  1.2 蜘蛛丝的种类  12-15
  1.3 丝蛋白结构特点与自组装  15-18
  1.4 蜘蛛丝的分子组成  18-25
  1.5 蛛丝的应用  25-29
  1.6 亲和层析蛋白纯化技术  29-32
  1.7 讨论  32-33
第2章实验材料与设计方案  33-46
  2.1 材料和仪器  33-40
  2.2 实验技术  40-46
第3章实验流程  46-68
  3.1 克隆构建  48-59
  3.2 蛋白表达  59-60
  3.3 筛选最优纯化条件  60-63
  3.4 大规模蛋白纯化  63-64
  3.5 蛋白溶液透析和冷冻干燥  64-65
  3.6 湿纺  65-66
  3.7 应力应变测试  66
  3.8 显微激光Raman测试  66-68
第4章结果分析  68-80
  4.1 克隆构建  68-69
  4.2 蛋白表达  69-70
  4.3 筛选最优纯化条件  70-73
  4.4 大规模蛋白纯化  73-74
  4.5 蛋白溶液透析和冷冻干燥  74-75
  4.6 冷冻王燥蛋白回溶  75-76
  4.7 湿纺纤维观察  76-77
  4.8 应力应变测试  77-78
  4.9 显微激光Raman测试单纤维二级结构  78-80
第5章结论与展望  80-85
  5.1 结论  80-82
  5.2 创新点  82-83
  5.3 展望  83-85
参考文献  85-91
硕士期间发表论文和参加科研情况说明  91-92
致谢  92-93
附录  93

基因工程仿生蜘蛛丝蛋白中重复模块对成丝性质的影响

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