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水稻tls基因启动子研究

作　者: 王惠梅
导　师: 凃巨民
学　校: 浙江大学
专　业: 作物学
关键词: 水稻 tls基因启动子克隆表达模式
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

几年前,在筛选明恢63/Bt转化系时获得了一株低结实率突变体。之后,利用TAIL-PCR技术对该突变体进行了插入位点分析,结果显示；由两个拷贝组成的外源Bt基因大片段的插入位点是位于水稻第10染色体的短臂靠近着丝点的位置上；进一步的序列比对分析证实该外源Bt基因大片段是插入在一个功能未知的基因的启动子序列之中。该突变体现已定名为tls (Temperature-regulated Low Seed-setting rate)突变体,相应的基因被命名为tls基因。生物信息学分析发现该基因的启动子序列中包含19个高温(Heat Shock Element, HSE)和两个干旱、低温和盐胁迫响应元件(Dehydration, low-temperature, and salt stress Responsive Element, DRE),外源基因的插入,使其中的9个高温HSE和1个DRE响应元件被隔开,并因此影响其对温度的反应能力,以至受到温度胁迫时其结实率下降。为了弄清tls启动子的分子和表达特征,我们用PCR方法扩增了tls基因启动子序列,并将其按HSE响应元件数目(4、10、11、15和19个)的多少截短成不同长度的片段后分别进行克隆,然后利用这些片段构建了5种表达质粒pH4, pH10, pH11, pH15和pH19,利用这些表达质粒分别转化粳稻品种日本晴,筛选得到足够数量的阳性转化体用于启动子表达活性和模式分析。利用半定量RT-PCR进行的基础表达分析结果表明：野生型和突变型启动子能驱动tls基因在根、茎、叶和花中表达,但两者的逆转录本在雌蕊上存在质的差异,即野生型有表达,突变型没有或仅有痕量表达；它们在根系上也存在明显差异,但表达趋势与雌蕊上的表达趋势刚好相反。当受到高温胁迫后,野生型和突变型启动子的表达都明显上调,但后者的上调幅度比前者更大；低温胁迫对两个启动子的上调作用有限,对野生型的影响直到第4天才能观察到,但对突变型的影响于第2天即可见。与温度胁迫反应结果相反,盐胁迫和模拟干旱处理后野生型和突变型启动子的表达总体上呈下调表达,且突变体和野生型以及盐胁迫和模拟干旱处理的趋势都一致,其不同时间取样点的动态变化特征是：显著下调(6h)-不完全的回复(12h)-轻微下调(48h)-再轻微下调(72h))。但在总体下调的程度上是野生型比突变体重和盐胁迫比模拟干旱处理的重。利用GUS组织化学和荧光定量分析对截短型和全长tls启动子的研究结果显示：(1)截短型启动子H4、H10不能有效驱动gus基因在转基因植株中表达；(2)截短型启动子H11、H15和全长启动子H19能驱动gus基因在转基因植株的根、茎、叶鞘、叶、颖壳和小花枝梗中表达,但其表达以叶中为最高；(3)所有启动子能驱动gus基因在所有转化体的花药中微弱表达,但不能驱动其在雌蕊、花丝和成熟的种子中表达；(4)高温、干旱、盐处理不能上调H4和H10驱动的gus基因在转化体中表达,但对H11、H15、H19驱动的gus基因在转基因植株中的表达有影响。

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