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漆酶高产菌株的选育及其酶学性质研究

作　者: 王诗然
导　师: 赵世光
学　校: 安徽工程大学
专　业: 微生物学
关键词: 漆酶低能离子束注入选育优化酶学性质
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来,有关漆酶的研究已引起人们的广泛关注。漆酶(Laccase. EC.1.10.3.2)是一种含铜离子的多酚氧化酶,广泛分布于真菌特别是白腐菌中。漆酶可与多酚类和芳香二胺类等多种底物作用,因此广泛应用于工业生产的各领域中。本文以漆酶产生菌灵芝菌(Ganoderma lucidum)U60为出发菌,采用低能N+束注入技术诱变选育得到漆酶高产菌株UIM-281,并对菌株产酶条件、漆酶的纯化、酶学性质进行了研究。主要研究结果如下：1、利用低能N+束注入技术对漆酶产生菌灵芝菌(Ganoderma lucidum)U60菌丝体进行辐照诱变。通过研究15 keV能量下不同注入剂量与灵芝菌存活率及突变率的生物学效应关系,确定了在2.6×1015～3.9×1015 ions/cm2注入剂量范围内可获得高比例正突变株。选择3:12×1015 ions/cm2的注入剂量参数后,经多轮注入诱变,获得了遗传性稳定的漆酶高产突株UIM-281；发酵产酶实验表明,UIM-281的产漆酶活力峰值分别是出发菌株U60的1.7倍及2.28倍,且产酶发酵周期相对缩短24 h,是工业发酵中更加经济高效的灵芝漆酶发酵菌株。2、通过单因素试验和Plackett-Burman设计法,进行灵芝菌UIM-281发酵产漆酶培养基主要因子的筛选,得到玉米粉、麸皮和ABTS的质量浓度三个显著因素。最陡爬坡实验逼近以上三因素最优水平后,应用中心组合设计以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,得到最优发酵条件为：玉米粉17.56 g/L,麸皮17.91 g/L, ABTS 0.0274 g/L葡萄糖10 g/L,豆粉10 g/L, KH2PO4 4.5g/L,经验证,在此条件下,漆酶酶活为6325.3 U/L,比化学合成培养基漆酶产量提高了将近1.27倍,该研究为工业发酵产漆酶提供了理论依据。3、首先采用Plackett-Burman(PB)设计法筛选出影响灵芝菌G. lucidumUIM-281发酵产漆酶的主效应因素为装液量、摇床转速和培养时间。最陡爬坡实验逼近以上三因素最优水平后,应用中心组合设计以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,得到最优发酵条件为：装液量52 mL,摇床转速158 r/min,培养时间172 h,温度28℃,接种量10%,初始pH5.5,种龄96h。上述条件下理论预测值8342.6U/L,验证实验测得酶活为8387.7U/L,与预测值接近,说明预测模型可靠性较高,可应用于漆酶发酵条件的优化。4、对UIM-281所产粗酶液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE),活性染色结果表明该漆酶无同工酶。通过35%-65%丙酮二级沉淀和微孔滤膜过滤进行纯化后,由SDS-PAGE测得漆酶的表观分子量约为46 KDa。漆酶酶学性质研究结果表明：该漆酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。在10℃和pH 4.8时保存具有最佳的稳定性；金属离子Mn2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+和抑制剂巯基乙醇、十二烷基硫酸钠和叠氮化钠对酶都有不同程度的抑制作用,其中Fe2+,十二烷基硫酸钠和叠氮化钠表现出强烈的抑制作用,而Co2+和Cu2+对酶有明显的激活作用,Zn2+和Na+则对酶活的影响不大；米氏常数Km为1.552 mmol/L。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-14
第1章绪论  14-22
  1.1 漆酶的研究进展  14-17
    1.1.1 漆酶的结构和性质  14-15
    1.1.2 漆酶来源  15-16
    1.1.3 漆酶发酵的研究  16-17
  1.2 漆酶的催化特点  17-18
  1.3 漆酶的应用  18-20
    1.3.1 真菌漆酶对木质素的降解  18
    1.3.2 环境保护  18-19
    1.3.3 食品加工  19
    1.3.4 造纸工业  19
    1.3.5 纺织业  19-20
    1.3.6 其他方面  20
  1.4 本论文研究目的及主要内容  20-22
    1.4.1 本论文研究目的  20-21
    1.4.2 主要研究内容  21-22
第2章低能离子注入诱变选育漆酶高产菌株  22-31
  2.1 材料与仪器  22-23
    2.1.1 菌株  22
    2.1.2 主要试剂  22-23
    2.1.3 主要仪器  23
    2.1.4 培养基  23
  2.2 实验方法  23-25
    2.2.1 样品处理与低能离子束注入工艺  23-25
    2.2.2 漆酶高产菌株筛选  25
    2.2.3 漆酶活力测定  25
  2.3 结果与分析  25-30
    2.3.1 低能离子注入的剂量效应关系  25-26
    2.3.2 离子注入剂量与突变率的关系  26-27
    2.3.3 漆酶高产菌株的筛选及遗传稳定性考察  27-29
    2.3.4 高产菌株与出发菌株发酵产酶特性的比较  29-30
  2.4 结论  30-31
第3章 UIM-281产漆酶发酵过程中营养条件的筛选与优化  31-42
  3.1 材料与方法  31-33
    3.1.1 材料  31-32
    3.1.2 试验方法  32
    3.1.3 发酵培养基的优化  32-33
  3.2 结果与分析  33-41
    3.2.1 单因素筛选试验  33-35
    3.2.2 Plackett-Burman法筛选实验  35-37
    3.2.3 最陡爬坡实验  37
    3.2.4 Box-Behnke试验和响应面分析  37-38
    3.2.5 多元二次响应面回归模型的建立与分析  38-40
    3.2.6 模型的验证  40-41
  3.3 结论  41-42
第4章 Ganoderma lucidum UIM-281产漆酶发酵过程优化  42-53
  4.1 材料与方法  42-43
    4.1.1 菌种  42
    4.1.2 培养基  42
    4.1.3 培养方法  42-43
    4.1.4 发酵条件优化设计  43
  4.2 结果与讨论  43-51
    4.2.1 PB筛选影响漆酶产量显著因子  43-45
    4.2.2 最陡爬坡实验  45
    4.2.3 响应面分析法优化漆酶产量发酵条件  45-51
  4.3 结论  51-53
第5章灵芝漆酶的分离及性质研究  53-67
  5.1 材料与方法  53-57
    5.1.1 菌种  53
    5.1.2 主要仪器  53
    5.1.3 主要试剂  53-55
    5.1.4 实验方法  55-57
  5.2 结果与分析  57-65
    5.2.1 漆酶同工酶分析  57-58
    5.2.2 丙酮分级沉淀  58
    5.2.3 表观分子量测定  58-59
    5.2.4 漆酶的酶学性质  59-65
  5.3 结论  65-67
第6章结论与展望  67-70
  6.1 结论  67-68
  6.2 展望  68-70
参考文献  70-76
攻读硕士学位期间所发表的论文  76-77
致谢  77

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