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三萜皂苷对离体培养的子宫内膜异位症内膜细胞作用的研究

作　者: 王娜
导　师: 陈素琴
学　校: 河北医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 内膜细胞复合酶消化法细胞培养三萜皂苷流式细胞学免疫细胞化学酶联免疫吸附试验
分类号: R711.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是妇科的常见病和多发病,是造成育龄期妇女盆腔疼痛和不孕症的重要原因之一,严重危害着广大妇女的身心健康,其发病率近年来有明显增高趋势。尽管关于子宫内膜异位症的发病原因学说很多,但其发病机理及病因尚不明确。近年来,我国学者对中药治疗子宫内膜异位症的作用机制进行了一些探索,发现许多中药能够从多途径、多角度、多层次发挥治疗作用。广义上的三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖、糖醛酸和其他有机酸组成的,以四环三萜和五环三萜两大类为主,均广泛分布于植物中。近年来,随着现代分离方法和结构测定技术的应用,使三萜皂苷的研究有了突破性进展,三萜皂苷的多种重要的生物活性和药理作用已被证实,如:抗癌、抗炎、抗过敏、治疗白血病、抗病毒、降血糖、防治心脑血管疾病等。我们所研究的三萜皂苷是黑升麻的提取物,本实验旨在通过建立子宫内膜异位症内膜细胞体外培养模型的方法,研究该方法的可行性,探讨子宫内膜细胞的生物学特性的同时研究三萜皂苷对子宫内膜异位症患者在位内膜细胞增殖、周期、凋亡及血管内皮生长因子(VEGF)分泌的影响,探讨三萜皂苷用于治疗子宫内膜异位症的可行性,为子宫内膜异位症的治疗提供新方法。方法:1.取子宫内膜异位症患者的在位内膜,采用胰酶胶原酶复合消化法,进行消化及体外培养,倒置相差显微镜观察内膜细胞的生长状态,MTT法观察内膜细胞的增殖能力,倒置相差显微镜、透射电镜及HE染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色,对人子宫内膜细胞进行鉴定。2.取子宫内膜异位症患者的在位内膜,采用胰酶胶原酶复合消化法,进行消化及体外培养和传代,取第3代内膜细胞分别给予浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的三萜皂苷并设空白对照组(不添加任何药物),观察内膜细胞生长状态并计数绘制内膜细胞生长曲线,MTT法观察内膜细胞的增殖能力;用流式细胞学的方法检测不同浓度药物对细胞周期和凋亡的影响。3.取第3代内膜细胞分别给予浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的三萜皂苷并设空白对照组(不添加任何药物)采用ELISA法测定三萜皂苷对VEGF分泌的影响。结果:1.所培养细胞为子宫内膜细胞,生长良好,在光镜下可观察到两种细胞:一种是间质细胞,呈多边形或梭形,培养3～4 d后细胞平铺生长,呈现中间稍宽、两端尖的形态,外形轮廓不甚清楚,细胞之间平行排列者居多,细胞质薄而透明,核居中,呈圆形或椭圆形;另一种细胞是腺上皮细胞,呈蝌蚪形,培养5～6 d后细胞呈团状排列,细胞间排列紧密,且常围绕成细胞集落,细胞轮廓较清晰,胞浆饱满,核大而圆。上皮细胞特异的细胞角蛋白抗体及间质细胞特异的波形蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,发现在子宫内膜异位症和正常子宫内膜体外模型中腺上皮细胞较少仅占30%左右,而间质细胞占多数,可达70%左右,且随着传代间质细胞所占比例越来越多,腺上皮细胞几乎消失。2.浓度为200μg/ml的三萜皂苷对内异症在位内膜细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05),而低浓度组虽无显著抑制作用(P>0.05),但其平均值均低于空白对照组,即存在细胞抑制的趋势;而各浓度对在位内膜细胞均不产生影响(P>0.05)。3.三萜皂苷可导致EMs在位内膜细胞周期发生改变,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞生长停滞于G 1期,但并没有诱导明显的细胞凋亡。4.浓度为200μg/ml的三萜皂苷对内异症在位内膜细胞分泌VEGF具有显著抑制作用(P<0.05),低浓度虽无显著抑制作用(P>0.05),但其均值均低于空白对照组,亦存在细胞抑制趋势。结论:1.采用复合酶消化法分离培养内膜细胞科学有效,细胞具有典型内膜细胞生物学特性。2.三萜皂苷对EMs内膜细胞增殖有抑制作用,且对正常细胞无影响;三萜皂苷可导致EMs在位内膜细胞周期发生改变,但并没有诱导明显的细胞凋亡。3.三萜皂苷对EMs内膜细胞分泌VEGF有抑制作用。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
研究论文三萜皂苷对离体培养的子宫内膜异位症内膜细胞作用的研究  9-39
  引言  9-10
  第一部分人子宫内膜细胞的体外培养及生物学特性研究  10-26
    前言  10
    材料与方法  10-13
    结果  13-14
    附图  14-21
    讨论  21-23
    小结  23-24
    参考文献  24-26
  第二部分三萜皂苷对体外培养子宫内膜细胞增殖、凋亡、周期和分泌VEGF 影响的研究  26-39
    前言  26
    材料与方法  26-28
    结果  28-30
    附图  30-31
    附表  31-32
    讨论  32-36
    小结  36
    参考文献  36-39
综述子宫内膜异位症模型用于中医药治疗机制研究的进展  39-56
致谢  56-57
个人简历  57

三萜皂苷对离体培养的子宫内膜异位症内膜细胞作用的研究

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