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高产Monacolin K红曲菌的诱变选育及其固态发酵条件的优化

作　者: 张良
导　师: 许杨
学　校: 南昌大学
专　业: 发酵工程
关键词: 红曲菌 Monacolin K 胶束电动毛细管色谱红曲米固态发酵
分类号: TQ920
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Monacolin K(莫纳可林K),也称Lovastatin(洛伐他汀)是红曲霉的次级代谢产物,能有效抑制胆固醇生物合成中的关键酶HMG-CoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰基-辅酶A还原酶)的活性,从而调节人体内血脂的水平。Monacolin K对人体具有降血脂、保护肾脏、抗癌等生理作用。含Monacolin K的红曲米被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物,受到世人瞩目。本文以筛选高产菌株和优化发酵条件为主要目的,建立了检测红曲米中Monacolin K的MEKC方法,采用紫外线-LiCl复合诱变方法获得一株高产Monacolin K红曲菌M16-4,并对其固态发酵培养基及培养条件进行了系统研究。主要研究内容和结果简述如下：1、建立了测定红曲米中Monacolin K含量的胶束电动毛细管色谱(MEKC)方法。考察了运行缓冲液的种类、pH及其浓度、有机添加剂、十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度和分离电压等实验条件对电泳分离效果及检测灵敏度的影响。在优化的实验条件下,以20 mmol/L硼砂(pH=10.6,含10%(体积分数)乙醇和40mmol/L SDS)作为缓冲溶液,Monacolin K能在23 min内实现很好的基线分离,检测线性范围为5.00-100.00 mg/L,线性相关系数R2为0.9976,检出限(以信噪比(S/N)为3计)为0.13 mg/L,加标回收率为98.5%-99.5%。精密度和稳定性试验中,峰面积和迁移时间的相对标准偏差均小5%,表明重复性良好。该方法简便、快速、灵敏,可用于红曲米中Monacolin K含量的测定。2、对实验室保存的32株红曲菌进行了初筛,得到4株相对高产MonacolinK的红曲菌：M16、M20、M25、M29。分别以上述4株红曲菌为出发菌株,采用紫外-LiCl复合诱变方法,用含Lovastatin的抗性筛选平板培养对诱变株进行筛选,最终筛选出一株红曲菌突变株M16-4。该菌株Monacolin K的产量为250.54μg/g,比出发菌株提高了20.3倍,连续传代4次后产量为247.83μg/g。3、采用单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面实验优化得到了红曲菌M16-4产Monacolin K的最优培养基：甘油5%、玉米浆2%、硝酸铵1%、乙酸钠1%、甲硫氨酸0.5%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%。以最优培养基为条件,采用单因素实验优化出得到的较佳发酵条件为培养基初始含水量50%,接种量10%,变温培养(30℃培养3d后,26℃培养12 d),培养时间15d,培养基初始pH5.5,装米量25g/250mL锥形瓶。在此条件下M16-4的Monacolin K产量达380.4μg/g,桔霉素含量为0.28μg/g。

全文目录

缩略语  3-4
摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-12
第一章文献综述  12-24
  1.1 红曲菌概述  12-14
    1.1.1 红曲菌的发现  12
    1.1.2 红曲菌的特征  12-13
    1.1.3 红曲菌的主要代谢产物  13-14
  1.2 Monacolin K的概述  14-17
    1.2.1 Monacolin K的发现  14
    1.2.2 Monacolin K的理化性质  14-15
    1.2.3 Monacolin K的药理作用和应用价值  15-17
  1.3 Monacolin K产生菌的选育  17-18
    1.3.1 菌种筛选  17
    1.3.2 诱变菌种  17-18
  1.4 Monacolin K的检测  18-19
  1.5 红曲中Monacolin K的发酵工艺  19-22
    1.5.1 发酵工艺  19-20
    1.5.2 培养基  20-21
    1.5.3 发酵条件  21-22
  1.6 研究的内容、目的和意义  22-24
第二章 MEKC法分析红曲中Monacolin K的研究  24-40
  2.1 引言  24
  2.2 材料与方法  24-25
    2.2.1 仪器与设备  24-25
    2.2.2 试剂  25
  2.3 实验方法  25-29
    2.3.1 电泳条件  25
    2.3.2 电解液的配制  25
    2.3.3 标准溶液的制备  25
    2.3.4 电泳条件的优化  25-27
    2.3.5 样品的前处理  27-28
    2.3.6 方法学考察  28
    2.3.7 数据处理  28-29
  2.4 实验结果  29-38
    2.4.1 电泳条件的优化  29-34
    2.4.2 样品的前处理  34-35
    2.4.3 方法学考察  35-38
  2.5 讨论  38-39
  2.6 小结  39-40
第三章高产Monacolin K菌株的复合诱变选育  40-55
  3.1 材料与方法  40-41
    3.1.1 菌种  40
    3.1.2 主要试剂和缓冲溶液  40
    3.1.3 主要仪器设备  40-41
    3.1.4 培养基  41
  3.2 实验方法  41-45
    3.2.1 菌株的活化与保存  42
    3.2.2 培养方法  42
    3.2.3 原始出发菌株的筛选  42
    3.2.4 诱变条件及方法  42-43
    3.2.5 筛选方法  43-44
    3.2.6 诱变菌株的稳定性试验  44
    3.2.7 分析方法  44-45
  3.3 实验结果  45-53
    3.3.1 原始菌出发菌株的筛选  45-46
    3.3.2 Lovastatin抗性筛选平板的抑制浓度的选择  46
    3.3.3 紫外线诱变剂量的选择  46-47
    3.3.4 紫外线-LiCl复合诱变剂量的选择  47-48
    3.3.5 紫外线-LiCl复合诱变筛选结果  48-51
    3.3.6 高产Monacolin K诱变菌株产桔霉素情况  51-52
    3.3.7 诱变菌株的稳定性试验  52-53
  3.4 讨论  53-54
  3.5 小结  54-55
第四章红曲菌M16-4固态发酵培养基及其培养条件的优化  55-80
  4.1 材料  55-56
    4.1.1 菌种  55
    4.1.2 培养基  55
    4.1.3 试剂  55-56
    4.1.4 主要仪器设备  56
  4.2 实验方法  56-59
    4.2.1 红曲固态发酵工艺流程  56
    4.2.2 红曲菌孢子悬液的制备  56
    4.2.3 种子液培养  56
    4.2.4 培养基优化实验设计  56-57
    4.2.5 培养条件实验设计  57-58
    4.2.6 测量方法  58-59
  4.3 实验结果  59-77
    4.3.1 种子生长曲线的制备  59-60
    4.3.2 优化培养基的单因素实验  60-62
    4.3.3 培养基优化的Plackett-Burman实验  62-66
    4.3.4 培养基优化的Box-Behnken实验  66-72
    4.3.5 单因素实验优化发酵条件  72-77
    4.3.6 较佳发酵条件实验结果  77
  4.4 讨论  77-79
    4.4.1 氮源对M16-4固态发酵产Monacolin K的影响  77-78
    4.4.2 无机盐对M16-4固态发酵产Monacolin K的影响  78-79
    4.4.3 培养条件对M16-4固态发酵产Monacolin K的影响  79
  4.6 小结  79-80
参考文献  80-85
致谢  85-86
攻读学位期间的研究成果  86

高产Monacolin K红曲菌的诱变选育及其固态发酵条件的优化

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