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应用母血浆中胎儿游离DNA进行无创性产前诊断的研究

作　者: 邹昕
导　师: 杜娟
学　校: 中南大学
专　业: 生殖工程学
关键词: 胎儿游离DNA 无创性产前诊断先天性肾上腺皮质增生症(CAH) COLD-PCR
分类号: R714.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

工作目的：建立母血浆中胎儿游离DNA分离提取的技术,利用SRY基因和RASSF1A基因检测胎儿游离DNA,并比较它们的检出率。利用母血浆中胎儿游离DNA分别结合传统巢式PCR法和低变性温度共扩增PCR法(COLD-PCR)对先天性肾上腺皮质增生症(CAH)的父源性致病点突变进行无创性产前遗传学诊断研究。研究方法：提取30例母血浆样本中的总DNA,应用Real-timePCR法对其中胎儿游离DNA成分进行SRY基因和RASSF1A基因的检测。提取1名曾生育CAH患者的孕妇的血浆DNA,分别应用传统巢式PCR法和COLD-PCR法扩增其中胎儿游离DNA中的CYP21基因片段,对产物进行变性高效液相色谱技术(dHPLC)和限制性酶切分析来检测父源性Q318X致病点突变。结果：30例母血浆中胎儿游离DNA样本中,16例检出了SRY基因,检出率为88.9%；26例检出了RASSF1A基因,检出率为86.7%。采用传统巢式PCR法和COLD-PCR法扩增CYP21基因片段后,dHPLC法和酶切分析法均检测到该胎儿遗传了父源性致病点突变Q318X,与羊水产前诊断结果一致。使用COLD-PCR法扩增后突变检测的效果要明显优于传统巢式PCR法。结论：建立了有效和稳定地分离提取母血浆中胎儿游离DNA的技术。运用胎儿游离DNA成功对一例CAH风险胎儿进行了无创性产前诊断。为开展其他单基因病的无创性产前遗传学诊断研究提供了新的思路。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
前言  13-16
第一部分两种标记验证母血浆中存在胎儿游离DNA的研究  16-30
  1 材料  16-19
    1.1 标本来源  16
    1.2 主要试剂  16-17
    1.3 仪器设备  17
    1.4 引物及探针  17-19
  2 方法  19-22
    2.1 血浆DNA及全血基因组DNA的获得  19-20
    2.2 甲基化特异性酶BstUⅠ消化反应  20
    2.3 Real-time PCR分析  20-22
  3 结果  22-27
    3.1 Real-time PCR检测SRY基因  22
    3.2 Real-time PCR检测RASSF1A基因和β-actin基因  22-27
  4 讨论  27-30
第二部分应用巢式PCR和COLD-PCR对点突变所致的先天性肾上腺皮质增生症进行无创性产前诊断的研究  30-46
  1 材料  30-33
    1.1 研究对象  30
    1.2 实验标本  30
    1.3 分子量标准  30-31
    1.4 主要试剂  31
    1.5 仪器设备  31
    1.6 引物  31-33
  2 方法  33-38
    2.1 血浆DNA及全血基因组DNA的获得  33
    2.2 PCR验证母血浆中含有胎儿游离DNA  33
    2.3 传统巢式PCR扩增致病突变所在基因片段  33-34
    2.4 COLD-PCR扩增致病突变所在基因片段  34-36
    2.5 突变分析  36-38
  3 结果  38-42
    3.1 PCR验证母血浆中含有胎儿游离DNA  38
    3.2 COLD-PCR中的Tc值确定  38-39
    3.3 dHPLC分析  39-40
    3.4 限制性酶切分析  40-41
    3.5 羊水产前基因诊断验证  41-42
  4 讨论  42-45
  5 结论  45-46
五. 参考文献  46-48
六. 综述  48-60
七. 致谢  60-62
八. 个人简历  62

应用母血浆中胎儿游离DNA进行无创性产前诊断的研究

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