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hMSCs与Col及Col-HA支架体外复合构建软骨及软骨下骨的研究

作　者: 周嘉安
导　师: 杨博；陈晓峰
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 骨组织工程 骨髓基质干细胞 生物支架材料 软骨修复 软骨下骨修复
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


关节软骨以及软骨下骨的损伤是骨科临床的常见疾病。临床对关节软骨损伤治疗的手段不少,但效果都不太理想。研究表明,骨髓基质干细胞作为一种具有多向分化潜能的干细胞,在适当的条件下可以被诱导分化成为软骨细胞和成骨细胞。本实验主要利用骨髓基质干细胞的这一特性,对其进行成软骨和成骨诱导,建立诱导和鉴定体系;并在这基础上,把骨髓基质干细胞与生物支架材料复合培养,在体外构建工程软骨和软骨下骨修复体。本研究主要成果如下:(1)从人骨髓中成功分离出长梭形、漩涡状分布的贴壁细胞,并通过流式细胞术证明分离并纯化得到的贴壁细胞确实是人骨髓基质干细胞hMSCs。(2)分离得到的hMSCs在成软骨诱导液的培养条件下高密度培养,得到直径约为0.5 mm的细胞微团。通过阿辛蓝染色、II型胶原的免疫组织化学染色、糖胺聚糖定量qRT-PCR等方法,从组织化学和分子生物学的层面对诱导结果进行检测和验证,最终建立了hMSCs成软骨的诱导和鉴定体系。(3)分离得到的hMSCs使用成骨诱导液进行单层培养,对成骨诱导21天的细胞进行碱性磷酸酶ALP染色、茜素红染色和I型胶原的免疫组织化学染色、碱性磷酸酶定量和qRT-PCR等,在组织化学和分子生物学的水平上对诱导结果进行检测和验证,最后成功的建立了hMSCs成骨的诱导和鉴定体系。(4)把得到的hMSCs接种到生物支架材料上。利用前文建立的成软骨诱导和鉴定体系,对COL和COL-HA两种生物支架材料进行比较。结果显示,COL生物支架材料相对于COL-HA生物支架材料更适合用于软骨缺损的修复。把得到的hMSCs接种到生物支架材料上。利用前文建立成骨诱导和鉴定体系,对COL和COL-HA两种生物支架材料的成骨特性进行比较。比较结果显示,COL-HA生物支架材料相对于COL生物支架材料更适合用于软骨下骨或骨组织缺损的修复。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章 绪论  12-21
  1.1 引言  12
  1.2 软骨、骨组织的细胞生理学  12-14
    1.2.1 软骨与软骨细胞  12-13
    1.2.2 骨细胞与成骨化  13-14
  1.3 骨组织再生工程  14-16
    1.3.1 骨、软骨再生的临床需要  14
    1.3.2 MSCs 在软骨修复工程中的应用  14-16
    1.3.3 MSCs 在骨修复工程中的应用  16
  1.4 生物支架材料  16-19
    1.4.1 软骨修复中的生物支架材料  16-18
    1.4.2 骨修复中的生物支架材料  18-19
  1.5 本实验研究背景及研究意义  19
  1.6 本课题的主要研究内容  19-21
第二章 人骨髓间充质干细胞的分离纯化及鉴定  21-26
  2.1 引言  21
  2.2 实验仪器与试剂  21-22
    2.2.1 实验仪器与耗材  21
    2.2.2 实验试剂  21-22
  2.3 实验方法和步骤  22-23
    2.3.1 hMSCs 的分离培养  22-23
    2.3.2 流式细胞术鉴定hMSCs 表面标志  23
  2.4 实验结果  23-24
    2.4.1 hMSCs 的分离培养  23-24
    2.4.2 流式细胞术鉴定hMSCs 的表面标志  24
  2.5 分析和讨论  24-25
  2.6 本章小结  25-26
第三章 hMSCs 成软骨、成骨诱导体系的建立  26-47
  3.1 引言  26
  3.2 实验仪器与试剂  26-30
    3.2.1 实验仪器与耗材  26-27
    3.2.2 实验试剂  27-30
  3.3 实验方法和步骤  30-36
    3.3.1 hMSCs 成软骨诱导  30
    3.3.2 石蜡包埋切片  30
    3.3.3 阿辛蓝染色鉴定hMSCs 的成软骨诱导  30
    3.3.4 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 的成软骨诱导  30-31
    3.3.5 糖胺聚糖（GAGs）定量  31
    3.3.6 实时定量PCR 检测成软骨相关基因的表达  31-33
    3.3.7 hMSCs 成骨诱导  33
    3.3.8 碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定hMSCs 成骨诱导  33
    3.3.9 茜素红染色鉴定hMSCs 成骨诱导  33
    3.3.10 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 成骨诱导  33
    3.3.11 细胞总蛋白的提取  33-34
    3.3.12 碱性磷酸酶（ALP）定量  34
    3.3.13 总蛋白定量  34
    3.3.14 实时定量PCR 检测成骨相关基因的表达  34-36
    3.3.15 统计学处理  36
  3.4 实验结果  36-42
    3.4.1 hMSCs 成软骨诱导  36
    3.4.2 阿辛蓝染色鉴定hMSCs 成软骨诱导  36-37
    3.4.3 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 成软骨诱导  37
    3.4.4 糖胺聚糖（GAGs）定量  37-38
    3.4.5 成软骨相关基因的表达  38-39
    3.4.6 hMSCs 成骨诱导  39-40
    3.4.7 碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定hMSCs 成骨诱导  40
    3.4.8 茜素红S 染色鉴定hMSCs 成骨诱导  40
    3.4.9 I 型胶原免疫组织化学鉴定hMSCs 成骨诱导  40-41
    3.4.10 碱性磷酸酶（ALP）定量鉴定hMSCs 成骨诱导  41-42
    3.4.11 成骨相关基因的表达  42
  3.5 分析和讨论  42-45
  3.6 本章小结  45-47
第四章 hMSCs 与 Col 支架复合构建关节软骨的研究  47-62
  4.1 引言  47
  4.2 实验仪器与试剂  47-50
    4.2.1 实验仪器与耗材  47-48
    4.2.2 实验试剂  48-50
  4.3 实验方法和步骤  50-54
    4.3.1 hMSCs 与生物支架材料复合  50
    4.3.2 MTT 法测定hMSCs 在生物支架材料上的增殖  50-51
    4.3.3 hMSCs 在生物支架材料上的成软骨诱导  51
    4.3.4 石蜡包埋与切片  51
    4.3.5 阿辛蓝染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导  51
    4.3.6 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导  51
    4.3.7 糖胺聚糖定量  51-52
    4.3.8 实时定量PCR 检测hMSCs 复合材料后成软骨相关基因的表达  52-53
    4.3.9 统计学处理  53-54
  4.4 实验结果  54-58
    4.4.1 MTT 法测定hMSCs 在生物支架材料上的增殖  54
    4.4.2 hMSCs 与生物支架材料复合成软骨诱导的石蜡切片染色  54-55
    4.4.3 阿辛蓝染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导  55-56
    4.4.4 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导  56-57
    4.4.5 成软骨相关基因的表达  57-58
  4.5 分析和讨论  58-60
  4.6 本章小结  60-62
第五章 hMSCs 与 Col-HA 支架复合构建软骨下骨的研究  62-76
  5.1 引言  62
  5.2 实验仪器与试剂  62-65
  5.3 实验方法和步骤  65-69
    5.3.1 hMSCs 在生物支架材料上的复合与成骨诱导  65
    5.3.2 石蜡包埋与切片  65
    5.3.3 碱性磷酸酶染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  65-66
    5.3.4 茜素红染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  66
    5.3.5 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  66
    5.3.6 hMSCs 复合生物支架材料总蛋白的提取  66
    5.3.7 hMSCs 复合生物支架材料碱性磷酸酶定量  66
    5.3.8 hMSCs 复合生物支架材料总蛋白定量  66
    5.3.9 实时定量PCR 检测hMSCs 复合材料后成骨相关基因的表达  66-68
    5.3.10 统计学处理  68-69
  5.4 实验结果  69-73
    5.4.1 hMSCs 与生物支架材料复合成软骨诱导的石蜡切片染色  69
    5.4.2 碱性磷酸酶染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  69-70
    5.4.3 茜素红染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  70-71
    5.4.4 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成骨诱导  71
    5.4.5 碱性磷酸酶定量  71-72
    5.4.6 hMSCs 复合材料后成骨相关基因的表达  72-73
  5.5 分析和讨论  73-75
  5.6 本章小结  75-76
结论与展望  76-79
参考文献  79-84
攻读硕士学位期间取得的研究成果  84-85
致谢  85

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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