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地衣芽孢杆菌产抗真菌物质的分离纯化

作　者: 胡云广
导　师: 崔堂兵；王强
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物工程
关键词: 地衣芽孢杆菌 抗真菌蛋白 离子交换层析 分子筛凝胶层析
分类号: S482.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从土壤中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑制作用的菌株,将其命名为BS-3。该菌株对水稻纹枯病、稻瘟病、苦瓜枯萎病等病原真菌均有较强抑制作用。通过对菌株BS-3的16S rDNA的序列测定和同源性比对,发现它与Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens等菌种的16S rDNA有高达100%的同源性,结合形态和生理生化指标,将其鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以产抗真菌蛋白最佳培养基对地衣芽孢杆菌BS-3进行摇瓶发酵,选用受其抑制作用较明显的水稻纹枯病病原真菌瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)作为指示菌,平板抑菌圈法检测BS-3发酵产物的抑菌活性。使用不同饱和度硫酸铵对BS-3菌株发酵液中的蛋白类物质进行盐析,确定最佳硫酸铵饱和度为50%。分别检测发酵上清液滤液、硫酸铵处理后离心沉淀和上清液的抑菌活性,结果表明BS-3的发酵上清液滤液、硫酸铵处理后离心沉淀对水稻纹枯病菌有较强抑菌活性。该抗菌蛋白粗提物具有较强热稳定性,对蛋白酶K和胰蛋白酶均有一定的耐受性。地衣芽孢杆菌BS-3菌株抗菌蛋白粗提物经DEAE-52阴离子交换层析后,从洗脱峰Ⅲ检测到抑菌活性,随后将该洗脱峰经Sephadex G-75凝胶层析后,得到两个峰,其中峰Ⅱ检测到了抑菌活性。该活性峰分别经SDS-PAGE和平板聚焦电泳,均显示为单一蛋白带,获知该蛋白分子量在31.0kD左右,等电点为5.41。该活性峰经C18反相HPLC柱检测,抗菌蛋白纯度达98.25%。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章 绪论  10-25
  1.1 芽孢杆菌的研究历史  10-14
  1.2 芽孢杆菌的分类方法  14-16
    1.2.1 经典分类(classic taxonomy)(形态特征)  14
    1.2.2 数值分类(numerical taxonomy)  14-15
    1.2.3 分子分类法(molecular taxonomy)  15-16
    1.2.4 化学分类(chemical taxonomy)  16
    1.2.5 多相分类(polyphasic taxonomy)  16
  1.3 抑真菌作用的研究  16-18
    1.3.1 芽孢杆菌抑真菌作用的研究  16-17
    1.3.2 地衣芽孢杆菌抑真菌作用的研究  17-18
  1.4 地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治  18-20
    1.4.1 抗菌物质的作用机制  18
    1.4.2 国内外研究动态  18-20
  1.5 地衣芽孢杆菌应用于饲料加工  20-21
    1.5.1 饲料添加剂的作用机制  20
    1.5.2 国内外研究动态  20-21
  1.6 地衣芽孢杆菌应用于医药  21-22
    1.6.1 整肠生的作用机制  21-22
    1.6.2 整肠生的临床试验  22
    1.6.3 地衣芽孢杆菌新型药剂的研究  22
  1.7 地衣芽孢杆菌应用于环境污染防治  22-23
    1.7.1 降解拟除虫菊酯类农药残留  22-23
    1.7.2 地衣芽孢杆菌吸附重金属离子  23
  1.8 本课题的研究意义与研究内容  23-25
    1.8.1 研究目的与意义  23-24
    1.8.2 研究内容  24-25
第二章 材料与方法  25-44
  2.1 实验材料  25-29
    2.1.1 菌种  25
    2.1.2 培养基  25-26
    2.1.3 主要药品试剂和缓冲液  26-28
    2.1.4 主要仪器设备  28-29
  2.2 实验方法  29-44
    2.2.1 菌株活化  29-30
    2.2.2 菌种鉴定  30-34
    2.2.3 有关抑真菌的实验方法  34
    2.2.4 抗菌物质的提取  34-36
    2.2.5 抗菌物质的分离纯化  36-38
    2.2.6 抗菌蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳  38-39
    2.2.7 蛋白质等电点测定  39-42
    2.2.8 蛋白浓度和纯度测定  42-44
第三章 结果与分析  44-57
  3.1 BS-3 菌株的鉴定  44-48
    3.1.1 DNA 浓度和纯度  44
    3.1.2 16S rDNA 序列比对  44
    3.1.3 16S rDNA 系统发育分析  44-45
    3.1.4 BS-3 菌株形态及生理生化特征  45-48
  3.2 抗菌物质的粗提取  48-51
    3.2.1 最佳硫酸铵饱和度的确定  48
    3.2.2 抗菌蛋白的抑菌活性  48-49
    3.2.3 抗菌蛋白的稳定性  49-51
  3.3 抗真菌物质的分离纯化  51-53
    3.3.1 DEAE-52 阴离子交换层析  51
    3.3.2 DEAE-52 离子交换层析收集峰的抑菌活性  51-52
    3.3.3 Sephadex G-75 分子筛凝胶层析  52-53
  3.4 抗菌蛋白等电点测定  53-54
    3.4.1 pH 梯度曲线制作  53-54
    3.4.2 等电点的计算  54
  3.5 抗菌蛋白纯度测定  54-55
  3.6 抗菌蛋白含量测定  55-57
    3.6.1 标准曲线的制作  55
    3.6.2 抗菌蛋白含量测定  55-57
结论  57-58
展望  58-59
参考文献  59-65
攻读硕士学位期间取得的研究成果  65-66
致谢  66-67
附表  67

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 杀菌剂 > 生物来源杀菌剂
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