学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

HIV膜融合抑制剂HR212表达、免疫原性检测及与5-helix病毒融合抑制的初步研究

作　者: 王久强
导　师: 刘思当
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 人免疫缺陷病毒 HR212 膜融合抑制剂 HIV假病毒同源建模
分类号: R512.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 3次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人类免疫缺陷综合症。目前FDA批准的用于临床的抗HIV的药物只是逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂,这两类药物在艾滋病的治疗方面已经取得了巨大的进展。但由于病毒基因的变异,导致了耐药株的出现,导致常规治疗方案失效。因此研究新的抑制剂对于抑制HIV病毒在体内的复制具有重要意义。HR212是由本实验室构建的一种膜融合抑制剂,前期研究证实此蛋白能够有效的抑制HIV-1假病毒感染细胞,并且其结构稳定,能耐受蛋白酶酶切作用。此蛋白具有和T20相似的抗病毒活性,且能够对T20耐药株也具有良好的抑制效果。HR212除了能够抑制HIV-1外,还对HIV-2具有部分抑制效果。前期HR212是以融合表达的形式进行表达的,由于其氨基端存在非目的片段,故不能正确表明其膜融合性质。为向将来的药物临床应用提供资料,我们拟非融合表达了HR212,同时也检测HR212的免疫原性。将HR212基因连接于pBV220上,经诱导表达、纯化后免疫小鼠。经间接ELISA验证HR212按照传统方法免疫能够得到抗体滴度,而以10倍治疗剂量按照治疗程序多次注射时,却仅在1/1000时检测到抗体滴度,此结果为下一步降低其免疫原性的方法探讨具有重要意义。此外,为了研制治疗性疫苗,我们构建了HR212的腺病毒表达体系。通过将HR212连接到穿梭质粒pDC315上,然后与骨架质粒共转染239细胞,经过7天后获得具有复制缺陷的重组腺病毒rAd-TPA-HR212。经Western Blot验证,成功得到了13.3 kd的目的蛋白。经假病毒抑制试验证实,经腺病毒表达的HR212能有效的抑制假病毒介导的膜融合过程。为下一步研究奠定了基础。人工构建的五螺旋蛋白(5-helix)能够抑制HIV介导的膜融合过程中发卡三聚体的形成,从而抑制病毒感染靶细胞。但5-helix基因在原核细胞中直接表达时易形成包涵体,复性困难,给研究带来不便。通过同源建模,模拟了5-helix在pGEX-6P-1载体及pET44b载体上的融合蛋白形成的最有可能的两种构象。通过对比发现,其在pET44b载体中与NusA的融和蛋白的溶剂化能远大于在pGEX-6P-1中的GST蛋白,并且酶切位点位于蛋白表面。因此我们将HR212连接于pET44b上,构建重组载体pET44b-PSP-5Helix,经转化、诱导、纯化后,经HIV假病毒抑制试验证明,此蛋白具有明显的抑制HIV假病毒的活性。

全文目录

英文缩略表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
综述部分  11-33
实验一 HIV 膜融合抑制剂 HR212 表达及免疫原性检测  33-39
  1 前言  33-34
  2 材料与方法  34-35
    2.1 试验材料  34
    2.2 试验方法  34-35
      2.2.1 载体构建  34
      2.2.2 蛋白表达及检测  34-35
      2.2.3 动物免疫  35
      2.2.4 间接 ELISA 检测抗体  35
  3 结果  35-36
    3.1 载体构建  35
    3.2 pBV220-HR212 表达产物的检测  35
    3.3 间接 ELISA 结果  35-36
  4 讨论  36-39
实验二 HIV 膜融合抑制剂HR212 在腺病毒中的表达及抑制 HIV 假病毒的活性  39-48
  1 前言  39-40
  2 材料与方法  40-43
    2.1 试验材料  40
    2.2 试验方法  40-43
      2.2.1 载体构建  40
      2.2.2 重组腺病毒rAd-TPA-HR212 包装  40-41
      2.2.3 重组腺病毒rAd-TPA-HR212 的大量扩增及纯化  41
      2.2.4 重组腺病毒的检测  41-42
        2.2.4.1 PCR 检测rAd-TPA-HR212 中目的基因  41
        2.2.4.2 Western Blot 检测 HR212 表达  41-42
      2.2.5 重组腺病毒感染滴度（TCID50）检测  42-43
      2.2.6 HIV 假病毒的包装及检测  43
      2.2.7 重组腺病毒抑制 HIV 假病毒活性  43
  3 结果  43-45
    3.1 TPA-HR212 基因的扩增及重组体的鉴定  43-44
    3.2 重组腺病毒PCR鉴定  44
    3.3 重组腺病毒 Western Blot 鉴定  44-45
    3.4 重组腺病毒感染滴度（TCID50）检  45
    3.5 重组腺病毒rAd-TPA-HR212 抑制假病毒的活性  45
  4 讨论  45-48
实验三HIV gp41 七肽重复区五螺旋蛋白的高效表达及对病毒融合抑制的初步探讨  48-57
  1 前言  48-49
  2 材料和方法  49-52
    2.1 试验材料  49
    2.2 5-Helix 表达载体的选择及酶切位点的设计  49-50
    2.3 5-Helix 基因的克隆  50-51
    2.4 5-Helix 蛋白的融合表达  51
    2.5 5-Helix 的细胞融合抑制试验  51-52
  3 结果  52-55
    3.1 5-Helix 的表达载体的选择及酶切位点的设计  52-53
    3.2 5-Helix 蛋白在大肠杆菌中高度可溶性表达  53-54
    3.3 5-Helix 能够抑制 HIV-1 囊膜蛋白介导的病毒和细胞的融合  54-55
  4 讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-68
致谢  68-69
个人简介及科研情况  69

HIV膜融合抑制剂HR212表达、免疫原性检测及与5-helix病毒融合抑制的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文