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假单胞菌株M18中pqsR基因的功能鉴定及las和rhl群体感应系统级联关系研究

作　者: 陆吉顺
导　师: 黄显清；许煜泉
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化工
关键词: 假单胞菌(Pseudomonas sp. M18) pqsR基因菌群传感藤黄绿菌素(Plt) 吩嗪-1-羧酸(PCA)
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

假单胞菌(Pseudomonas sp. M18)是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种,其分泌的藤黄绿菌素(pyoluteorin, Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid, PCA)等抗生素能有效抑制植物病原真菌。本课题主要针对于假单胞菌M18中的群体感应(quorum sensing,QS)系统,首先研究了群体感应系统中的一个重要调控基因pqsR对包括PCA和Plt在内的一些次级代谢产物生物合成及其基因表达的调控机理。同时,本文还研究了las和rhl QS系统在假单胞菌M18中的级联调控关系,揭示了菌株M18中复杂特异的QS调控网络。首先,运用PCR技术从M18菌株中克隆pqsR基因,并通过同源重组技术构建了该基因的抗性插入突变株。与野生菌株相比,pqsR突变株产红色素能力缺失,而菌体生长稍优于野生型菌株。利用HPLC技术进一步监测pqsR基因突变对PCA和Plt合成的影响,发现pqsR基因在M18菌株中区别性调控这两种抗生素的合成,pqsR强烈抑制Plt的生物合成,而对PCA合成存在显著的正调控作用。通过反式互补实验以及lacZ翻译融合测定进一步证明了pqsR对Plt与PCA生物合成及其基因表达的调控作用,并且构建了Plt高产工程菌株M18PRG。论文进一步利用转录融合分析及半定量RT-PCR方法对Plt与PCA合成基因转录水平进行了测定,结果表明Plt与PCA生物合成基因在转录水平上受到pqsR的调控。此外,还发现PqsR突变对途径专一性激活子PltR的表达没有显著的影响,表明PqsR对Plt生物合成的调控并不是通过PltR介导的。同时鉴于pqsR突变株表型与rhl菌群传感系统突变株表型非常相似,最初我们推测pqsR基因与rhl菌群传感系统可能涉及同一调控通路。然而,BHL和HHL信号分子(由RhlI合成)合成的TLC生物测定结果显示:pqsR基因的突变对于这些信号分子的合成没有明显的影响,表明pqsR基因并非通过rhl菌群传感系统发挥其调控作用。其次,我们通过lacZ翻译融合表达分析和酰基高丝氨酸内酯薄层层析生物测定,研究了las和rhl QS系统在M18菌株中的调控关系。结果表明,M18中的QS级联关系非常复杂,与铜绿假单胞菌株相比存在显著的差异。其中las QS系统负调控rhlI的表达;虽然lasI抑制rhlR的表达,lasR却在对数生长期对rhlR具有正调控作用。上述调控关系表明,las与rhl QS系统中四个主要调控因子LasI、LasR、RhlI、RhlR能独立表达并行使其功能。同时我们还发现las QS系统能调控rhlI与rhlR最高表达水平的时间和强度。实验结果还表明lasR对PCA合成的负调控作用是由rhlI所介导。所有结果表明假单胞菌M18中QS系统的相互级联关系具有菌株特异性。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-9
第一章文献综述  9-28
  1.1 假单胞菌简介  9
  1.2 假单胞菌的生物防治机理  9-11
  1.3 抗生素在生物防治中的作用  11-18
    1.3.1 藤黄绿菌素（Plt）  12-13
    1.3.2 吩嗪及其衍生物  13-16
    1.3.3 2，4-二乙酰藤黄酚（Phl）  16-17
    1.3.4 硝吡咯菌素（Prn）  17
    1.3.5 粘质酰胺（viscosinamide）  17
    1.3.6 氢氰酸(hydrogen cyanide, HCN)  17-18
  1.4 群体感应(quorum sensing ,QS)系统  18-26
    1.4.1 革兰氏阴性菌(G~-)的QS 系统  19-26
  1.5 研究目的和主要内容  26-28
    1.5.1 研究目的  26-27
    1.5.2 研究内容  27-28
第二章材料和方法  28-32
  2.1 培养基  28
  2.2 菌株培养和保藏条件  28
  2.3 抗生素的使用  28-29
  2.4 DNA 常规操作技术  29
  2.5 Plt 和 PCA 的定量分析  29
  2.6 β-半乳糖苷酶活性的测定  29-30
  2.7 大肠杆菌和假单胞菌感受态细胞的制备  30
  2.8 高丝氨酸内酯信号分子的提取  30-31
  2.9 高丝氨酸内酯的生物学检测  31-32
第三章假单胞菌M18 中pqsR 基因的鉴定及其功能研究  32-56
  3.1 材料与方法  32-37
    3.1.1 菌株和与质粒  32-33
    3.1.2 pqsR 基因突变菌株M18PRG 的构建  33-35
    3.1.3 过表达质粒pOPQR 构建  35
    3.1.4 RNA 的提取和反转录  35-36
    3.1.5 半定量RT-PCR  36-37
  3.2 结果  37-51
    3.2.1 pqsR 基因的PCR 克隆和测序  37-38
    3.2.2 pqsR 基因对假单胞菌M18 生长的影响  38-39
    3.2.3 pqsR 基因对假单胞菌M18 色素产生能力的影响  39-40
    3.2.4 pqsR 基因对Plt 和PCA 合成的影响  40-44
    3.2.5 pqsR 在转录水平上调控Plt 和PCA 合成基因簇的表达  44-48
    3.2.6 pqsR 基因对于 pltR 表达的影响  48-49
    3.2.7 pqsR 基因对于HHL 和BHL 合成的影响  49-51
  3.3 讨论  51-56
第四章假单胞菌 M18 中 las 和 rhl QS 系统的级联关系研究  56-65
  4.1 材料与方法  56-57
    4.1.1 菌株和与质粒  56-57
    4.1.2 lasR rhlI 基因双突变菌株 M18IR 的构建  57
  4.2 结果  57-61
    4.2.1 QS 系统对 PCA 合成的影响  57-58
    4.2.2 las QS 系统对 rhlI’-‘lacZ 翻译融合表达的调控  58-60
    4.2.3 las QS 系统对 rhlR’-‘lacZ 翻译融合表达的调控  60
    4.2.4 QS 系统对 BHL 和 HHL 信号分子合成的调控  60-61
  4.3 讨论  61-65
    4.3.1 假单胞菌 M18 中存在一个新的、复杂的 las 和 rhl 级联调控系统  62-63
    4.3.2 luxR 家族基因的表达不完全与其相应的 luxI 家族基因相偶联  63-64
    4.3.3 las QS 系统影响 rhlI 和 rhlR 最高表达时间和强度  64-65
参考文献  65-79
附录实验所用试剂及仪器设备  79-80
致谢  80-82
攻读硕士期间论文(待)发表情况和所获奖励  82-84

假单胞菌株M18中pqsR基因的功能鉴定及las和rhl群体感应系统级联关系研究

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