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精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌中argJ基因的功能研究

作　者: 蔡冬梅
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: L-精氨酸钝齿棒杆菌 argJ 鸟氨酸乙酰转移酶 α、β亚基
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 37次
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内容摘要

L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)是一种半必需氨基酸,是生物体尿素循环的重要中间代谢产物,对机体维持正常的生理功能有重要作用,因此L-精氨酸在医药、食品及化妆品等领域有极为广泛的应用。论文以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) JNPH5-8为研究对象,通过对其L-精氨酸合成途径中鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ的功能分析,考察增强argJ基因的表达量对重组钝齿棒杆菌产物L-精氨酸积累的影响。C. crenatum JNPH5-8是本实验室保藏的一株高产L-精氨酸突变株,本论文对其鸟氨酸乙酰转移酶(ornithine acetyltransferases,OATase)的催化功能类型进行了分析鉴定,检测结果表明,C. crenatum JNPH5-8的OATase是一个双功能酶,兼具线性途径中乙酰谷氨酸合成酶和乙酰鸟氨酸酶的功能。以不产L-精氨酸的C. glutamicum ATCC13032为对照,发现C. crenatum JNPH5-8的OATase粗酶比活力高67.4 %。为探讨其酶活力高的原因,将来源于两株菌的argJ基因分别进行了克隆分析,并在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达,结果表明,两株菌中OATase编码基因存在13个碱基的差异,引起了3个氨基酸残基的突变,但纯酶活力分析发现,其粗酶比活力的差异与编码基因本身的差异无关,而与两株菌中OATase的酶量差异有关。OATase是由α、β两个亚基组成的异二聚体,在诱导温度低于16℃时,OATase以可溶性的亚基状态存在。对α、β亚基进行分别表达的实验结果表明,单独的α、β亚基不存在OATase的催化活性,亚基分开表达再混合后也不再显示OATase的活力,说明保守区的自动裂解对于OATase活性中心的形成是必须的。此外,对α、β亚基的分别敲除发现OATase也不再具备催化活性,基因缺失菌株不能合成L-精氨酸,α、β亚基的缺失阻断了L-精氨酸的合成通路。基于以上研究,本论文将argJ基因在C. crenatum JNPH5-8中进行了增强表达,构建了重组穿梭表达质粒pJC1-tac-argJ。与出发菌株相比,重组菌C. crenatum (pJC1-tac-argJ)的OATase粗酶比活力提高90.9%,L-精氨酸积累量提高16.8%,单位菌体产酸量提高24.6%,这表明,提高菌体中OATase的表达量可以增强L-精氨酸合成途径的代谢通量。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-13
  1.1 L-精氨酸的性质及应用  7-8
    1.1.1 L-精氨酸的生物学意义  7
    1.1.2 L-精氨酸的应用  7-8
  1.2 L-精氨酸的生产现状  8
  1.3 L-精氨酸在生物体内的合成途径  8-10
  1.4 L-精氨酸生产的国内外研究进展  10-11
    1.4.1 L-精氨酸在传统诱变育种方面的研究进展  10
    1.4.2 L-精氨酸在基因工程育种方面的研究进展  10-11
  1.5 鸟氨酸乙酰转移酶的研究进展  11-12
    1.5.1 鸟氨酸乙酰转移酶的功能  11
    1.5.2 鸟氨酸乙酰转移酶的研究进展  11-12
  1.6 立题意义与研究内容  12-13
    1.6.1 立题意义  12
    1.6.2 研究内容  12-13
第二章材料与方法  13-24
  2.1 菌株与质粒  13
  2.2 培养基与培养方法  13-14
    2.2.1 培养基  13-14
    2.2.2 培养方法  14
  2.3 主要试剂与工具酶  14-16
    2.3.1 生化试剂  14
    2.3.2 蛋白质相关试剂  14-15
    2.3.3 工具酶及其他试剂  15
    2.3.4 抗生素的配制  15
    2.3.5 溶菌酶的配制  15
    2.3.6 IPGT 溶液的配制  15
    2.3.7 SDS-PAGE 电泳试剂的配制  15-16
    2.3.8 SDS-PAGE 电泳凝胶的配制  16
    2.3.9 镍琼脂糖凝胶FF 亲和色谱缓冲液的配制  16
  2.4 主要仪器  16-17
  2.5 实验方法  17-24
    2.5.1 发酵参数分析  17-18
    2.5.2 棒杆菌基因组DNA 的提取  18
    2.5.3 谷氨酸棒杆菌与钝齿棒杆菌 argJ 基因的扩增  18
    2.5.4 钝齿棒杆菌OATase 中α、β亚基的分别扩增  18-19
    2.5.5 PCR 产物与T 载体的连接  19
    2.5.6 大肠杆菌感受态的制备及转化  19
    2.5.7 大肠杆菌重组质粒的抽提  19-20
    2.5.8 重组质粒中插入片段的序列测定及分析比对  20
    2.5.9 基因片段与载体pET-28a、pJC1-tac 的连接  20
    2.5.10 钝齿棒杆菌感受态细胞的制备与电击转化  20-21
    2.5.11 重组目的蛋白的表达与纯化  21-22
    2.5.12 SDS-PAGE 电泳方法  22
    2.5.13 酶活测定  22
    2.5.14 基因敲除  22-23
    2.5.15 钝齿棒杆菌重组菌与出发菌的发酵特性比较  23-24
第三章结果与讨论  24-39
  3.1 钝齿棒杆菌中OATase 的功能鉴定  24-29
    3.1.1 钝齿棒杆菌与谷氨酸棒杆菌中argJ 的PCR 扩增及序列分析  24-25
    3.1.2 钝齿棒杆菌与谷氨酸棒杆菌中OATase 粗酶比活力的测定  25
    3.1.3 重组质粒pET-28a-argJ(Cg)、pET-28a-argJ(Cc)的构建  25-26
    3.1.4 argJ 基因在大肠杆菌中的表达与纯化  26-27
    3.1.5 重组OATase 纯酶比活力的测定  27
    3.1.6 重组OATase 的功能研究  27-29
  3.2 OATase 催化作用机理的初步研究  29-35
    3.2.1 α、β亚基的分别表达及活性分析  29-31
    3.2.2 α、β亚基的分别敲除及活性分析  31-35
  3.3 argJ 基因在C. crenatum 中的增强表达  35-39
    3.3.1 重组穿梭表达载体pJC1-tac-argJ 的构建  35
    3.3.2 钝齿棒杆菌重组菌与出发菌OATase 粗酶比活力的差异  35-36
    3.3.3 钝齿棒杆菌重组菌与出发菌发酵产L-精氨酸的差异  36-37
    3.3.4 钝齿棒杆菌重组菌与出发菌发酵液中氨基酸含量分析  37-39
第四章结论与展望  39-41
致谢  41-42
参考文献  42-46
附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  46-47
附录2：核苷酸序列  47-48

精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌中argJ基因的功能研究

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